CHO细胞表达重组蛋白的固定化金属亲和层析(IMAC)工艺优化及其在生物制药中的应用潜力

本研究针对哺乳动物细胞(CHO)分泌重组蛋白时固定化金属亲和层析(IMAC)技术存在的培养基兼容性差、杂质清除效率低等难题，通过系统优化Ni Sepharose excel树脂的载量、洗涤(添加Triton X-100/PS80&TnBP/2-propanol)和洗脱条件(25 mM NaCl+150 mM咪唑)，实现HCP从90,000 ppm降至16,000 ppm的突破性清除，并验证树脂54次循环的稳定性能，为生物药工业化生产提供高效经济的纯化方案。

　　

在生物制药领域，重组蛋白的纯化一直是制约生产效率和成本的关键瓶颈。虽然固定化金属亲和层析(IMAC)因其对组氨酸标签(His-tag)的特异性结合而被广泛用于大肠杆菌表达系统，但当面对更复杂的哺乳动物细胞(如CHO细胞)表达体系时，这项技术却遭遇了"水土不服"——细胞培养基中的还原剂和螯合剂会导致金属离子剥离，而宿主细胞蛋白(HCP)等杂质清除效率低下，单次纯化后HCP水平往往超过40,000 ppm。更棘手的是，传统IMAC树脂需要繁琐的预透析和金属离子重新加载步骤，使得工艺开发周期延长2-3周。这些技术痛点如同"三座大山"，严重阻碍了IMAC在工业化生产中的应用，目前仅有不到5%的生物药许可申请(BLA)采用该技术。

针对这些挑战，来自中国的研究团队在《Journal of Chromatography Open》发表了一项突破性研究。他们另辟蹊径地选择了一种新型的Ni Sepharose excel树脂，其特有的三(羧甲基)乙二胺(TED)五齿配体不仅能抵抗EDTA和还原剂的侵蚀，还展现出10 mg/mL的惊人载量。通过系统优化，研究人员发现向洗涤缓冲液中加入1% Triton X-100或PS80&TnBP组合，可像"分子扫帚"般将HCP清除效率提升近50%，而含25 mM NaCl的150 mM咪唑洗脱缓冲液则如同"精准钥匙"，既能维持产物稳定性又使单体回收率高达92.9%。更令人振奋的是，该工艺在54次重复使用中始终保持稳定的产品质量属性(PQAs)，且残留镍离子<10 μg/L，完全符合ICH Q3D的严苛标准。

这项研究主要运用了四类关键技术：1)采用动态结合容量(DBC)测定评估树脂载量衰减；2)通过SEC-HPLC监测单体/聚体比例；3)运用CHO HCP ELISA和qPCR定量杂质清除效率；4)结合ICP-MS和荧光HPLC追踪金属离子及PS80残留。这些方法如同"多维度探针"，全面解析了工艺优化的每个环节。

在"洗脱条件筛选"部分，线性梯度实验证实咪唑的洗脱效率远超组氨酸和pH调节，而适量NaCl的加入则意外地改善了单体与高分子量(HMW)物种的分离，使纯度提升1.9个百分点。"载量影响"研究发现10 mg/mL是载量"甜蜜点"，超过此值虽可提高SEC纯度，但会牺牲10%以上的收率。

"洗涤条件优化"章节堪称"杂质清除的百宝箱"：15种添加剂筛查显示，非离子型去污剂通过削弱疏水相互作用，使HCP清除率提升47%，而离子型添加剂如0.5 M CaCl₂
反而会干扰特异性结合。考虑到制药规范，最终推荐PS80&TnBP组合作为Triton X-100的安全替代方案。

"树脂寿命研究"犹如一场马拉松测试：54次循环后树脂结合容量衰减21%，但通过质量平衡研究证实，这种衰减主要源于流穿峰增加而非产物降解。更难得的是，1 M NaOH的严苛清洗后，SDS-PAGE检测显示残留蛋白<0.0013 mg/mL树脂，显微镜观察也证实树脂形态保持稳定。

该研究的结论部分画龙点睛地指出，这种优化的IMAC工艺不仅将HCP水平从90,000 ppm降至16,000 ppm——较文献报道降低60%，更通过省略预透析步骤大幅缩短工艺时间。虽然TED树脂的寿命(54次)略短于传统NTA/IDA树脂(>100次)，但其节省的缓冲液消耗和操作时间可显著降低生产成本。作者特别强调，洗涤液中添加的PS80&TnBP可能产生"一箭双雕"效应——既能清除杂质又可能灭活包膜病毒，这为后续病毒验证研究提供了新思路。

这项研究犹如为IMAC技术装上了"中国引擎"，不仅破解了哺乳动物细胞表达系统纯化的难题，更通过详实的寿命数据打消了工业应用的顾虑。正如文中所言，该方案已成功拓展至多种表达系统，为生长因子(TGF-β/VEGF)和敏感酶类(蛋白酶/激酶)等"娇贵"蛋白的纯化开辟了新路径。在生物药研发成本高企的今天，这种兼顾效率与经济性的纯化策略，或许将成为加速创新药上市的"隐形推手"。