基于HILIC-MS/MS技术的脂溶性抗肿瘤TriPPP ro前药及其极性代谢物在HT29细胞提取物中的同步定量方法开发

本研究针对核苷类似物前药系统TriPPP ro的细胞内代谢机制不明问题，开发了一种HILIC-MS/MS同步定量方法，成功实现了脂溶性前药（如5-FU衍生物）与亲水性代谢物（FdU-MP/DP/TP）在HT29细胞裂解液中的精准检测（线性范围2-1000 ng/mL），为抗肿瘤药物代谢动力学研究提供了创新分析工具。

　　

在抗癌药物研发领域，核苷类似物作为经典的抗代谢药物，其疗效高度依赖细胞内磷酸化激活过程。然而这类化合物面临双重困境：极性磷酸化产物难以穿透细胞膜，而前体药物又存在代谢效率低下的问题。德国汉堡大学医学中心的研究团队开发的Tri^PPP
ro技术通过双脂质掩蔽γ-磷酸基团，虽解决了细胞膜穿透难题，但长期以来缺乏精准量化前药摄取与代谢转化的分析方法。

为突破这一技术瓶颈，Michelle Vogts等人在《Journal of Chromatography B》发表研究，建立了首个能同步检测Tri^PPP
ro前药体系所有代谢产物的HILIC-MS/MS方法。该研究创新性地采用XBridge Premier Amide色谱柱，通过三元梯度（乙腈/水/碳酸氢铵缓冲液）实现了从脂溶性前药（如m/z 977.1的Tri^PPP
ro 1）到极性代谢物（如m/z 484.9的FdU-TP）的共洗脱，结合MTBE-甲醇-水的液液萃取方案，解决了磷脂干扰和磷酸酶降解等样本制备难题。

关键技术包括：1）基于实验设计（DoE）优化色谱条件，确定5 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 8.3）为最佳添加剂；2）建立含磷酸酶抑制剂的样本处理流程；3）采用d4T和UMP同位素内标进行质谱校正。

研究结果显示：

1. 方法开发：验证线性范围覆盖2-1000 ng/mL，FdU-TP检测限达4.08 ng/mL，Tri^PPP
   ro 1回收率42%。
2. 代谢动力学：HT29细胞摄入1小时后，70%前药转化为活性代谢物（FdU-TP 2.18 μM），证实"锁定效应"；长链烷基修饰的Tri^PPP
   ro 2代谢更缓慢（24小时胞内积累达7.19 μM）。
3. 稳定性差异：短链前药在培养液中易水解为中间体（1.99 μM），而长链衍生物更稳定，提示结构优化方向。

该研究首次完整揭示了Tri^PPP
ro系统的代谢路径：前药通过被动扩散入胞→酯酶逐步脱掩蔽→释放FdU-TP抑制DNA合成，同时FdU-MP（1.13 μM）阻断胸苷酸合成酶（TS）。所建立的方法灵敏度较传统HPLC-UV提升100倍，为前药设计提供了关键的代谢动力学评价工具，尤其对解决5-FU耐药性问题具有重要价值。未来可扩展至抗病毒药物研发领域，为核苷类药物递送系统的优化提供标准化分析方案。