大肠杆菌中蚓激酶蛋白基因的异源表达及其高效溶栓活性研究

本研究针对传统蚓激酶提取工艺复杂、周期长等问题，开发了基于大肠杆菌（E. coli）的异源表达新策略。通过16°C低温表达成功实现三种蚓激酶蛋白（A0A0P0YK20/A8ILN1/Q8I6N3）的可溶性表达，其纤溶活性分别达7040 U/mL、46,772.6 U/mL和21,800 U/mL，显著优于文献报道值。该技术突破了蚯蚓源生产限制，为缺血性脑卒中治疗提供了标准化生产方案。

　　

在全球脑卒中负担日益加重的背景下，缺血性脑卒中因其高致残率和有限治疗时间窗成为重大公共卫生挑战。尽管组织纤溶酶原激活剂(tPA)是当前金标准，但其4.5小时的治疗窗口和出血风险限制了临床应用。传统蚯蚓提取的蚓激酶(lumbrokinase)虽具有靶向溶栓优势，却面临生产周期长（依赖蚯蚓生长）、工艺复杂（需多步层析）和批次差异大等产业化瓶颈。

为突破这些限制，来自湖北爱泰克生物科技有限公司与北京中医药大学的研究团队创新性地采用大肠杆菌表达系统，通过低温诱导策略（16°C）成功实现三种蚓激酶蛋白的高效可溶性表达。研究采用液质联用技术(LC-MS/MS)鉴定蚯蚓源蚓激酶组分后，构建重组表达载体，通过SDS-PAGE和酶活检测验证表达效果，最终建立了一套可规模化生产的工艺体系。

材料与方法
研究团队首先从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)中提取天然蚓激酶，经AKTA系统纯化后，采用10 kDa超滤离心管浓缩样本。关键实验技术包括：1）基于UniProt环节动物数据库的LC-MS/MS蛋白质鉴定；2）SIM HF培养基的低温诱导表达；3）纤维蛋白平板法测定酶活；4）分子排阻色谱纯化。

主要结果

1. 质谱鉴定明确靶标蛋白
   通过LC-MS/MS分析锁定三个高覆盖率的蚓激酶亚型（A0A0P0YK20覆盖度48.7%，A8ILN1覆盖度43.2%，Q8I6N3覆盖度35.1%），其肽段匹配数均超过15条，为后续基因克隆提供精确模板。

2. 低温表达突破包涵体瓶颈
   将诱导温度从常规37°C降至16°C后，可溶性蛋白比例提升3.2倍。SDS-PAGE显示三条清晰目的条带（约28-32 kDa），Western blot验证无降解。

3. 酶活数据刷新行业记录
   重组表达的A8ILN1酶活高达46,772.6 U/mL，是文献记载值的6.8倍。值得注意的是，单体蛋白的溶栓效率比复合体形态提升40%，提示单一亚型可能更适于临床制剂开发。

4. 纯化工艺残留挑战
   尽管镍柱纯化获得>90%纯度，质谱仍检测到大肠杆菌宿主蛋白污染（如GroEL），需进一步优化层析条件。

讨论与展望
该研究首次系统比较了不同蚓激酶亚型的溶栓效能，证实大肠杆菌表达体系可实现工业化量产。相较于毕赤酵母系统（需100小时发酵），本方案将生产周期缩短至48小时内，且规避了甲醇诱导的安全风险。特别值得注意的是，A8ILN1展现的超高酶活为开发新一代溶栓药物提供了优选分子，其通过抑制IRE1通路调控内质网应激的机制，可能解释其优于复合制剂的神经保护效果。

遗留问题在于宿主蛋白残留可能引发免疫反应，未来可通过标签优化（如SUMO标签）或连续层析策略改进。这项发表于《Journal of Chromatography B》的工作，不仅为脑卒中治疗提供了更经济的生物药选择，其低温表达策略更为其他难表达蛋白的生产提供了普适性技术参考。