基于LC-MS/MS替代基质法的人血清C4(7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮)定量分析及其临床应用研究

本研究开发并验证了一种采用LC-MS/MS技术和替代基质策略的人血清C4(7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮)定量分析方法。研究人员通过使用5% BSA in PBST作为替代基质，结合稳定同位素标记内标(C4-d7 )和支撑液液萃取(SLE)技术，建立了0.200-200 ng/mL的线性检测范围，准确度达97.9%-101%，为胆汁酸合成和CYP7A1活性评估提供了高灵敏度、高特异性的检测方案。

　　

在胆固醇代谢和胆汁酸合成的复杂调控网络中，7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮(C4)作为关键中间代谢物，已成为评估肝脏CYP7A1酶活性和胆汁酸合成速率的重要生物标志物。然而，由于人血清中内源性C4的存在，传统定量方法面临基质匹配和灵敏度不足的挑战。Takeda Development Center Americas的研究团队在《Journal of Chromatography B》发表的研究，创新性地建立了基于LC-MS/MS的替代基质分析方法。

研究采用5%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液(5% BSA in PBST)作为替代基质，结合稳定同位素标记内标(C4-d₇
)和支撑液液萃取(SLE)技术，通过优化色谱条件（ACQUITY UPLC BEH C8柱）和APCI离子源参数，实现了0.200 ng/mL的检测灵敏度。临床样本分析证实该方法可稳定检测室温24.7小时、-80°C保存34天的样本。

【Method development】部分显示，研究团队系统优化了色谱分离条件，采用乙腈/水(含0.1%甲酸)梯度洗脱，使C4与结构类似物有效分离。【Conclusions】证实该方法线性范围覆盖三个数量级(0.200-200 ng/mL)，且样本可经10倍稀释后仍保持准确性。稳定性实验表明，C4在冻融循环、长期低温储存等条件下均保持稳定。

这项研究的意义在于：首次建立无需衍生化处理的C4高灵敏度检测方案，为临床研究胆汁酸代谢异常相关疾病（如高胆固醇血症、脑腱性黄瘤病）提供了可靠工具。通过替代基质策略解决了内源性干扰难题，其方法学验证严格遵循M10指南，检测性能显著优于既往报道方法。该技术的应用将促进对CYP7A1调控机制和胆汁酸合成通路的深入研究，为相关代谢疾病的诊断和治疗监测奠定基础。