人源器官样支气管细胞培养体系在人类偏肺病毒临床分离中的优越性研究

本研究针对人类偏肺病毒(HMPV)临床分离效率低的难题，通过对比人源器官样支气管细胞(ODB)培养与传统Vero-118单层细胞培养的效果，发现ODB体系对B型HMPV分离效率提升64%，病毒载量显著更高(P<0.001)，为呼吸道病毒研究提供了更接近生理状态的分离模型。

　　

呼吸道病毒感染一直是全球公共卫生的重要挑战，其中人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus, HMPV)作为Pneumoviridae
家族成员，是导致儿童和成人呼吸道感染的主要病原体之一。自2001年在荷兰首次被发现以来，HMPV的实验室分离始终面临重大技术瓶颈——传统单层细胞培养体系不仅耗时长（常需多次传代），且对临床样本中B型病毒的分离效率尤其低下。更棘手的是，病毒在传代过程中可能发生适应性变异，导致分离株不能真实反映流行毒株特征。这些限制严重阻碍了HMPV的基础研究和疫苗开发进程。

近年来，类器官技术的突破为病毒学研究带来了新机遇。人源器官样支气管细胞(Organoid-Derived Bronchial, ODB)培养体系能高度模拟人体气道生化特征，特别是含有病毒天然靶细胞——纤毛细胞。前期研究已证实HMPV在ODB中优先感染纤毛细胞，这与动物实验观察到的感染模式高度一致。这些发现引发了一个关键科学假设：ODB体系能否突破传统细胞培养的限制，成为更高效的HMPV临床分离平台？

针对这一命题，荷兰伊拉斯姆斯医学中心的研究团队开展了一项开创性研究。他们系统比较了ODB与标准Vero-118细胞对36例2022-2023季节HMPV阳性临床样本的分离效率，通过多维度分析揭示了ODB体系的显著优势。该研究成果发表在《Journal of Clinical Virology》，为呼吸道病毒学研究提供了方法学革新。

研究采用三项核心技术方法：1) 基于Panther Fusion系统的RT-qPCR初筛(C_T
≤25的临床样本)；2) 平行接种ODB与Vero-118培养体系，通过病毒载量动力学(0-9 dpi)和免疫荧光染色监测感染；3) Illumina全基因组测序分析培养适应性变异。样本来源于荷兰住院患者的呼吸道标本，经Sanger测序分型确认包含A2.2.1、A2.2.2、B1和B2等当前流行谱系。

3.1 流行毒株基因分型

对36例临床样本的F基因分析显示，2022-2023季节荷兰主要流行B2谱系(18/36)，其次为A2.2.2(7/36)、B1(7/36)和A2.2.1(4/36)。值得注意的是，早期发现的A1和A2.1谱系已完全消失，印证了HMPV的持续进化特征。

3.2 分离效率比较

ODB体系展现出显著优势：单次传代即可获得27株分离株(8株A型，19株B型)，而Vero-118细胞需1-2次传代仅获得21株(9株A型，12株B型)。尤为关键的是，对B型病毒的分离成功率从Vero体系的12%(首代)提升至ODB的76%(p<0.005)。病毒载量动力学显示，ODB中病毒RNA峰值提前至3 dpi且维持稳定，而Vero细胞中5 dpi达峰后即下降(P<0.001)。免疫荧光证实ODB中27例出现特异性蛋白表达，与病毒复制曲线高度吻合。

3.3 基因组变异分析

全基因组测序揭示重要发现：虽然两组培养物均未出现显著适应性突变，但Vero传代病毒在F、P、M等基因的非同义突变频率更高。例如A2.2.1分离株F基因突变增加3.5倍，B1株P基因突变增加4.2倍。所有分离株中G基因变异频率最高，这可能与免疫逃逸压力相关。

这项研究首次系统论证了ODB培养体系在HMPV临床分离中的核心价值：对于当前主要流行的B型病毒，其分离效率较传统方法提升64%，且能更快速获得高病毒载量分离株。这一突破具有三重意义：

方法学层面，建立了基于纤毛细胞感染的标准化分离流程，解决了B型HMPV"难分离"的历史难题。研究者特别指出，ODB的成功率与临床样本Ct值无关，提示其对低病毒载量样本同样适用。

病毒学层面，全基因组数据证实ODB分离株更接近原始临床毒株，减少了体外适应性变异风险。这对疫苗候选株筛选和中和抗体研究尤为重要——传统Vero培养可能导致关键抗原表位改变，而ODB体系能最大限度保留病毒天然特性。

临床转化层面，该研究为呼吸道病毒研究提供了新范式。尽管ODB目前存在成本高、操作复杂等限制，但其在模拟天然感染方面的优势，使其成为研究病毒-宿主互作的理想平台。随着类器官技术的标准化推进，这类生理相关模型有望逐步替代传统细胞系，推动呼吸道病毒学研究进入"类器官时代"。

值得注意的是，研究发现A型病毒在两种体系中分离效率相当(73-82%)，提示血清型特异性差异可能源于病毒附着蛋白的分子特征。这为后续研究指明了新方向——解析HMPV血清型特异性宿主因子互作机制，将有助于开发广谱抗病毒策略。

该团队在讨论中特别强调，ODB体系成功的关键在于其完整保留了人体气道的生化微环境，包括内源性蛋白酶系统等病毒复制必需因子。这种生理相关性对HMPV等"挑剔"病毒尤为重要，也为其他难培养呼吸道病毒(如HCoV-HKU1)的分离提供了技术借鉴。随着单细胞测序和类器官培养技术的融合，未来有望构建更精细化的呼吸道病毒研究模型，加速抗病毒药物和疫苗的临床转化进程。