七种来源开菲尔粒中优势菌种的鉴定及其在开菲尔粒重构中的应用研究

本研究针对开菲尔粒形成机制不明确的科学难题，通过培养依赖法结合MALDI-TOF MS分析，系统鉴定了7种来源开菲尔粒的核心微生物群。研究发现乳酸菌Lactobacillus kefiranofaciens ssp. kefiranofaciens（产kefiran多糖亚种）与L. kefiri等菌种的特定组合可成功重构具有对数生长能力的开菲尔粒，为揭示这种传统发酵剂的形成机制提供了重要实验依据。

　　

开菲尔粒作为高加索地区传承百年的天然发酵剂，其乳白色弹性颗粒中蕴含着复杂的微生物共生体系。这种由乳酸菌和酵母菌嵌入kefiran多糖基质形成的特殊结构，虽已广泛应用于乳制品发酵，但其形成机制始终是未解之谜。早期研究曾误将开菲尔粒的形成归因于Lactobacillus brevis，直到日本学者在1980年代通过特殊培养基分离出关键菌株Lactobacillus kefiranofaciens ssp. kefiranofaciens（产kefiran多糖亚种）及其近缘亚种ssp. kefirgranum（非产kefiran亚种），才为理解这一神秘体系打开突破口。然而，现代高通量测序技术难以区分这两个16S rRNA序列相同的亚种，加之常规MRS培养基无法培养关键菌株，导致相关研究长期停滞。

为破解这一难题，研究人员系统收集了丹麦、日本、俄罗斯等7个来源的开菲尔粒样本。通过改良的Rogosa牛奶乳清（RMW）琼脂培养基和延长培养时间等策略，成功分离鉴定核心菌群。研究采用MALDI-TOF MS质谱分析和菌落形态学相结合的方法，精确区分了传统方法难以鉴定的微生物亚种。

研究发现所有开菲尔粒均含有9 log cfu g^-1
的乳酸菌，其中L. kefiranofaciens占87%（含18%产kefiran的ssp. kefiranofaciens和82%非产kefiran的ssp. kefirgranum），L. kefiri占12%。值得注意的是，ssp. kefirgranum中存在25-41%具有絮凝生长特性的菌株，这些菌株在液体培养基中会形成特殊的细胞束结构。酵母菌群（6-7 log cfu g^-1
）中仅Kazachstania exigua普遍存在于所有样本。

在微生物重构实验中，研究人员创新性地采用"种子混合物"策略：将L. kefiranofaciens ssp. kefiranofaciens JCM6985^T
型菌株与L. kefiri等菌种在特定固体培养基上共培养后接种至复原脱脂乳。实验MIX322M显示，仅含上述两种菌种的初始组合即可形成"原始开菲尔粒"，但需补充L. parakefiri才能实现对数生长。优化后的MIX432M方案通过分离培养不同菌群，获得了细胞密度接近天然颗粒的重构产物。

研究结果表明：

1. 开菲尔粒的形成起始于L. kefiranofaciens ssp. kefiranofaciens与L. kefiri/L. parakefiri的核心互作
2. ssp. kefirgranum的絮凝与非絮凝菌株共同维持颗粒结构稳定性
3. 酵母菌K. exigua可能不参与颗粒形成过程
4. 重构颗粒虽具有弹性特征，但体积较小且长期培养后生长能力下降

这项研究首次实现了基于纯培养菌株的开菲尔粒重构，不仅建立了包含培养基选择、菌种鉴定和重构流程的标准化方法，更重要的是揭示了不同微生物亚种在颗粒形成中的层级作用。该发现为传统发酵食品的标准化生产提供了理论依据，也为研究微生物共生体系形成机制提供了新模式。论文的创新性在于突破了常规培养方法的限制，通过精细区分微生物表型差异，为解开开菲尔粒这一"微生物活化石"的形成之谜提供了关键线索。