生乳奶酪中传染性流感病毒提取方法的比较研究及其在食品安全监测中的应用

针对高致病性禽流感H5N1病毒通过生乳制品传播的潜在风险，研究人员系统比较了五种提取方法从不同质构奶酪中回收传染性H1N1病毒（甲型流感病毒代表株）的效率。研究发现TGBE缓冲液与柠檬酸钠混合法对软质奶酪、单一TGBE法对硬质奶酪的病毒回收率最优，检测限达3-4 log PFU，为食品安全监管提供了标准化检测工具。该成果发表于《Journal of Food Protection》，对评估乳制品传播流感病毒风险具有重要公共卫生意义。

　　

近年来，高致病性禽流感H5N1病毒（HPAI H5N1）在鸟类和哺乳动物中的广泛传播引发全球关注。2024年该病毒在奶牛中的爆发及其在乳汁中的高浓度排泄，为人类暴露创造了新途径。尽管巴氏杀菌能有效灭活流感病毒，但加拿大等国家允许使用生乳制作奶酪，而目前尚缺乏流感病毒在奶酪中的存活数据及标准化提取方法。这一空白使得评估乳制品传播风险成为亟待解决的公共卫生问题。

加拿大食品安全研究团队针对这一挑战，以H1N1病毒为甲型流感病毒模型，鼠诺如病毒（MNV）为过程对照，系统比较了五种提取方法从四种生乳奶酪（奶油奶酪、布里奶酪、切达奶酪和硬质成熟奶酪）中回收传染性病毒的效率。研究通过斑块试验和数字PCR技术，建立了适用于不同奶酪质构的标准化检测流程。

关键技术方法包括：1）使用TGBE缓冲液（含甘氨酸、Tris和牛肉提取物）和柠檬酸钠缓冲液分别进行病毒提取；2）通过超高速离心和聚乙二醇沉淀法浓缩病毒；3）采用MDCK细胞系进行H1N1斑块试验，BV-2细胞系进行MNV检测；4）基于M基因特异性引物的数字PCR定量病毒RNA。

研究结果
提取方法比较：在奶油奶酪模型中，TGBE法与混合缓冲液法的病毒回收率显著优于聚乙二醇沉淀法（后者因沉淀难溶解被淘汰）。超速离心法虽能回收病毒，但效率过低（<1%）。混合缓冲液对软质奶酪的提取效果最佳，而TGBE更适用于硬质奶酪。

检测限确定：对于奶油奶酪和布里奶酪，传染性病毒检测限为4 log PFU和3.7 log PFU；切达奶酪和硬质奶酪可达3 log PFU。低于此浓度时，虽能检测到病毒RNA片段，但无法确认传染性。

MNV回收率：作为无包膜病毒代表，MNV在硬质奶酪中的回收率高达44.3%（TGBE法），显著高于软质奶酪（4.8%），提示奶酪成分显著影响提取效率。

讨论与意义
该研究首次建立了从生乳奶酪中回收传染性流感病毒的标准化方法，解决了现有检测技术仅针对病毒核酸的局限性。研究发现硬质奶酪中病毒回收率更高，可能与脂肪含量（31-38%）及基质结构有关，但其他因素如水分活度、微生物群落等仍需进一步探究。

尽管人工接种实验存在局限（与实际生产中的病毒分布可能存在差异），但该方法已成功应用于包膜病毒（如蜱传脑炎病毒）的检测体系。研究提出的混合缓冲液策略通过柠檬酸钠螯合钙离子，有效破解了奶酪基质对病毒颗粒的包裹，为食品安全监测提供了新工具。

这项由Madeleine Blondin-Brosseau等学者完成的工作，不仅为评估H5N1通过乳制品传播的风险提供了技术支撑，其建立的双方法检测体系（TGBE法用于硬质奶酪、混合缓冲液法用于软质奶酪）更可扩展至其他食源性包膜病毒的监测。论文发表于《Journal of Food Protection》，对制定生乳制品安全标准具有重要指导价值。