多黏菌素B联合疗法延缓肺炎克雷伯菌耐药性的机制研究：聚焦nlpE基因调控AcrAB-TolC外排泵及双组分系统通路

针对多黏菌素B(PMB)单药治疗易诱导耐药的问题，研究人员通过体外连续诱导实验结合转录组和蛋白质组学分析，发现PMB与阿米卡星(AMK)联用可延缓耐药性6天，并揭示外膜脂蛋白nlpE通过调控PhoP/Q-PmrA/B双组分系统和AcrAB-TolC外排泵介导耐药。该研究为临床抗感染联合用药提供了新靶点。

　　

在全球抗生素耐药危机加剧的背景下，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)引起的医院获得性感染已成为临床治疗难题。多黏菌素B(PMB)作为"后抗生素时代"对抗多重耐药菌的最后防线，其耐药率却从2022年的7.9%攀升至2023年的10.9%。更棘手的是，药代动力学研究显示PMB单药治疗难以维持有效血药浓度，且体外实验证实即使超临床浓度使用仍会出现细菌再生和耐药。虽然PMB与美罗培南(MEM)、阿米卡星(AMK)、替加环素(TGC)等联用可增强抗菌活性，但最佳组合方案尚未明确，耐药延迟机制更是迷雾重重。

重庆医科大学附属第二医院的研究团队在《Journal of Global Antimicrobial Resistance》发表的研究，通过创新性的多组学联用策略，不仅筛选出最优联合方案，更首次揭示外膜脂蛋白nlpE作为耐药调控"枢纽"的全新机制。研究人员从重庆某三甲医院ICU分离7株临床菌株（包括碳青霉烯敏感和耐药株），采用棋盘稀释法测定PMB与4种抗生素的协同效应，通过体外连续诱导实验模拟临床耐药演化过程。借助RNA-seq、qRT-PCR和DIA定量蛋白质组学技术，对比分析诱导耐药株与联合用药延迟耐药株的基因表达差异，并构建nlpE基因敲除及回补菌株验证其功能。

关键实验技术
研究采用棋盘微量稀释法评估药物协同效应，体外连续诱导实验模拟耐药发展过程，RNA-seq和qRT-PCR分析耐药相关基因表达，DIA定量蛋白质组学检测差异蛋白，通过同源重组技术构建nlpE基因敲除株(21-K81/ΔnlpE::Apr)和回补株(21-K81/ΔnlpE::Apr/pRK415-nlpE)。

主要研究结果

3.1 药物敏感性变化
PMB单药诱导1-2天即可引发耐药（MIC升至16 μg/mL），而PMB+AMK/TGC组合将耐药出现时间延迟至6天。CAZ/AVI在2 MIC浓度下5天内诱导显著耐药，但低浓度(1/2 MIC)15天内未现耐药。

3.2 联合药敏分析
PMB/AMK对敏感株21-K9和耐药株F160070的协同效果最佳（FICI=0.5），使PMB MIC降低12.8-16倍；对CRKP株THR-09，PMB/FOS和PMB/TGC分别实现10.67和8倍MIC降低。

3.3 耐药延迟效应
6株菌中，1 μg/mL PMB+0.25 μg/mL AMK使21-K9耐药延迟至第7天，相同方案对其他菌株延迟5-6天。值得注意的是，PMB/MEM和PMB/FOS组合无显著延迟效果。

3.4 转录组学发现
耐药株中phoQ、arnE、pagP等脂质A修饰基因表达上调2.6-8.5倍，而联合治疗组这些基因表达下调4.1-6.3倍。KEGG富集显示差异基因主要涉及脂多糖生物合成和ABC转运体通路。

3.5 蛋白质组学验证
NlpE蛋白在耐药株中表达上调1.99倍，在延迟耐药组下调0.79倍。GO分析证实差异蛋白富集于阳离子抗菌肽(CAMP)耐药通路，其中BamE、GmhB等外膜蛋白表达模式与NlpE一致。

3.6 基因调控网络
qRT-PCR显示耐药株中phoP/Q、pmrA/B、cpxA/R等双组分系统基因及acrB外排泵基因表达显著升高，而延迟耐药组表达降低。引人注目的是，mgrB与phoP/Q呈现同步表达，挑战了传统负反馈认知。

3.7 nlpE功能验证
敲除nlpE使菌株耐药延迟至6天，且PhoQ、PmrA等蛋白不再响应PMB诱导；回补nlpE后耐药重现且相关蛋白表达恢复。蛋白质组热图显示，野生型和回补株经PMB处理后，ArnA-T、PagP等脂质A修饰蛋白及AcrB外排泵显著上调，而敲除株无此变化。

研究结论与意义
该研究首次阐明nlpE通过三重机制调控PMB耐药：1）激活PhoP/Q-PmrA/B双组分系统促进脂质A修饰；2）通过CpxA/R-MarA轴上调AcrAB-TolC外排泵表达；3）与mgrB形成动态调控网络。PMB+AMK组合通过抑制nlpE表达，阻断上述通路从而延迟耐药。这一发现不仅为临床联合用药提供优选方案（PMB+AMK/TGC优于PMB+MEM/FOS），更揭示nlpE可作为逆转耐药的新靶点。研究者建议未来可开发针对nlpE的小分子抑制剂，或通过监测nlpE表达水平预测耐药风险，为个体化抗感染治疗提供新思路。