提高抗RANKL单抗生物类似药RGB-14免疫原性检测中靶标耐受性的策略与临床验证

本研究针对抗RANKL单抗生物类似药RGB-14临床样本检测中因靶标(RANKL)干扰导致的假阳性问题，通过优化免疫原性检测方法（ADA assay），成功将靶标耐受性从30 pg/mL提升至10,000 pg/mL。研究人员通过去除酸解离步骤、添加靶标特异性试剂及调整稀释倍数，解决了传统桥接法电化学发光(ECL)检测中RANKL二聚体/三聚体引发的假阳性信号，为生物类似药临床免疫原性评估提供了可靠方法。

　　

在生物类似药研发领域，免疫原性评估是证明其与原研药相似性的关键环节。然而，当匈牙利Gedeon Richter Plc的研究团队开发抗RANKL（核因子κB受体活化因子配体）单抗生物类似药RGB-14时，遭遇了一个棘手难题：临床样本中异常升高的RANKL水平导致传统免疫原性检测方法出现大规模假阳性结果。这一发现不仅挑战了现有检测技术的可靠性，更揭示了生物类似药临床评估中靶标干扰这一长期被低估的风险。

研究团队最初开发的电化学发光桥接法（ECL bridging assay）严格遵循FDA和EMA指南，通过验证时能耐受30 pg/mL RANKL——这一阈值是基于当时文献报道的健康人群RANKL水平（多数<20 pg/mL）。但实际检测RGB-14 I期临床试验样本时，假阳性率远超预期。深入研究发现，接受denosumab治疗的患者血清中RANKL浓度竟高达验证阈值的300倍以上。这种异常现象可能源于药物阻断RANKL-RANK通路后引发的生理反馈调节，导致游离RANKL蓄积。

为解决这一技术瓶颈，研究团队对检测方法进行了三项关键改进：首先去除酸解离步骤以避免RANKL多聚体形成；其次添加特异性阻断试剂中和游离靶标；最后将样本稀释倍数提高至60倍。改进后的方法（Method 2）靶标耐受性显著提升至10,000 pg/mL，并通过完整验证。这一突破不仅保障了RGB-14临床研究的可靠性，更建立了应对高浓度可溶性靶标干扰的标准化解决方案。

关键技术方法包括：1）基于MSD平台的ECL桥接免疫分析，用于抗denosumab抗体（ADA）检测；2）采用健康人血清（n=50）和骨质疏松患者样本建立cut-off值；3）通过添加重组RANKL评估靶标干扰；4）比较酸处理前后信号差异分析假阳性机制。

ADA方法1验证结果
初始方法在健康人群中验证时表现出色：灵敏度达250 ng/mL，药物耐受性为10 μg/mL，符合生物类似药评估要求。但临床样本检测中，82%的假阳性率暴露了方法缺陷。

靶标干扰机制研究
通过添加外源RANKL证实，当浓度>30 pg/mL时，RANKL会形成二聚体/三聚体，在桥接法中模拟ADA信号。酸解离步骤反而加剧了这一现象。

方法2性能验证
改进后的方法将靶标耐受性提高333倍（至10,000 pg/mL），同时保持灵敏度（250 ng/mL）和精密度（CV<20%）。临床样本复测显示假阳性率降至可接受范围。

这项发表于《Journal of Immunological Methods》的研究具有双重意义：在实践层面，为抗RANKL类药物建立了可靠的免疫原性检测标准；在方法论层面，揭示了生物类似药临床样本可能存在的"靶标蓄积效应"，强调验证时需超越文献报道的生理浓度。Tímea Pap等研究者特别指出，即使通过现行指南验证的方法，仍需密切监控临床数据异常，这对未来生物类似药开发具有普遍指导价值。研究结果同时提示，RANKL在denosumab治疗患者中的动态变化可能成为监测骨代谢的新指标，为相关疾病机制研究开辟了新视角。