新型富组氨酸糖蛋白检测系统的开发：脓毒症生物标志物的突破性进展

脓毒症早期诊断缺乏高特异性生物标志物，日本冈山大学团队针对富组氨酸糖蛋白(HRG)开发了新型双抗体(69-1A/75-2D)夹心ELISA检测系统。研究发现HRG浓度与脓毒症严重程度显著负相关(p<0.01)，该系统可同时检测HRG两种亚型(Form-1/Form-2)，为脓毒症诊疗提供新工具。

　　

脓毒症作为感染引发的全身炎症反应综合征，每年导致全球1100万人死亡，其早期诊断一直是临床难题。现有生物标志物如降钙素原(PCT)和C反应蛋白(CRP)存在假阳性率高、特异性不足等问题。日本临床实践指南(J-SSCG 2020)虽推荐4种标志物联合使用，但仍无法满足急诊、ICU等场景的快速诊断需求。更棘手的是，脓毒症患者常出现多器官功能衰竭，单一生物标志物难以全面评估病情进展。

在这一背景下，冈山大学研究团队将目光投向了一种特殊蛋白——富组氨酸糖蛋白(HRG)。这种由肝脏合成的糖蛋白含有66个组氨酸残基，在凝血、免疫调节等过程中发挥关键作用。前期研究发现，脓毒症患者血浆HRG浓度会从健康人的100-150 μg/mL急剧下降，这种变化可能源于肝脏合成减少、凝血酶降解或血栓沉积三种机制。但现有商业ELISA试剂盒检测性能不佳，严重阻碍了HRG的临床应用。

为解决这一技术瓶颈，研究人员开发了新型HRG检测系统。通过小鼠淋巴结免疫法获得21种单克隆抗体，经系统筛选发现69-1A和75-2D抗体组合对HRG两种亚型(75 kDa的Form-1和77 kDa的Form-2)均具有高亲和力。表位定位显示这两种抗体结合域均不涉及第204位氨基酸(Pro/Ser多态性位点)，因此能同时识别两种亚型。临床验证表明，脓毒症患者HRG水平显著低于健康对照(p<0.01)，证实了该系统的诊断价值。

关键技术方法包括：1)从人血浆中纯化HRG标准抗原；2)通过杂交瘤技术制备21种单抗；3)采用棋盘法筛选最佳抗体组合；4)建立夹心ELISA检测流程；5)用免疫印迹验证抗体特异性。

Selection of antibody sets for the sandwich assay
通过棋盘滴定法评估所有21种抗体的210种组合，最终选定69-1A(捕获抗体)与75-2D(检测抗体)组合，其吸光度(OD)值达3.0以上(+++级)，显著优于其他组合。

Discussion
研究发现HRG浓度动态变化与脓毒症进展高度相关，新开发的ELISA系统解决了传统方法无法区分HRG亚型的技术缺陷。该系统采用双抗体夹心设计，避免了镍柱纯化法可能导致的表位遮蔽问题。

Conclusions
75-2D/69-1A ELISA系统实现了HRG的高精度检测，为脓毒症预后评估提供了新工具。该技术未来还可拓展至其他疾病领域，如血栓性疾病和肿瘤的辅助诊断。

这项发表于《Journal of Immunological Methods》的研究具有重要临床意义：首先，HRG作为"负向标志物"的独特性质弥补了现有脓毒症诊断标志物体系的不足；其次，新抗体系统克服了商业试剂盒对HRG亚型识别不全的缺陷；更重要的是，该技术平台可整合到全自动免疫分析系统中，满足急诊、ICU等场景的快速检测需求。研究团队特别指出，HRG浓度变化可能反映脓毒症相关的凝血-炎症交叉调控机制，这为探索脓毒症发病机制提供了新视角。