综述：从Cas蛋白到前沿生物传感器：临床病原体诊断的新时代

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins）技术在病原体诊断领域的革命性进展，重点介绍了基于Cas9、Cas12、Cas13和Cas14的多种生物传感器设计原理及其在病毒（如SARS-CoV-2、HPV）、细菌（如结核分枝杆菌、MRSA）和真菌（如曲霉菌）检测中的应用，展现了其高灵敏度（低至aM级）、单碱基分辨率和即时检测（POCT）潜力。

　　

CRISPR/Cas系统：开启病原体诊断的精准时代

引言
传染性病原体对全球健康和社会经济稳定构成严峻挑战。传统检测方法如ELISA和PCR虽可靠，但存在成本高、耗时长、依赖复杂仪器等局限。CRISPR/Cas技术的出现为病原体诊断带来了突破性解决方案，其高特异性、低成本和便携性使其成为新一代诊断工具的核心。

CRISPR/Cas系统概述
CRISPR/Cas系统最初被发现是细菌的适应性免疫机制，通过crRNA引导Cas蛋白靶向切割外源核酸。根据效应蛋白结构，可分为Class I（多蛋白复合物）和Class II（单效应蛋白）。其中Class II的Cas9、Cas12、Cas13和Cas14因操作简便成为研究热点：

• Cas9：通过sgRNA识别PAM序列，切割双链DNA产生平末端，但需tracrRNA辅助。
• Cas12：自主加工crRNA，识别T-rich PAM序列，兼具顺式和反式切割单链DNA能力。
• Cas13：专一靶向RNA，通过HEPN结构域非特异性切割周围RNA，无需PAM序列。
• Cas14：唯一可切割单链DNA的小型Cas蛋白，对单核苷酸多态性（SNP）检测极具优势。

生物传感策略的创新

1. 可视化检测

   • 纸基平台NASBACC通过Cas9实现Zika病毒单碱基分辨检测，无需专业设备。
   • SHERLOCKv2整合多种Cas蛋白（Cas13a/b），可同时检测登革热病毒和肺癌突变基因。

2. 荧光信号放大

   • DETECTR系统结合重组酶聚合酶扩增（RPA）和Cas12a，实现HPV16/18的aM级灵敏度检测。
   • HOLMES技术通过PCR预扩增和Cas12b反式切割，完成SARS-CoV-2 RNA的定量分析。

3. 电化学与SERS传感

   • 石墨烯-dCas9传感器对SARS-CoV-2 Delta变体的检测限达1.2 pM，临床灵敏度100%。
   • 金纳米花增强的SERS-CRISPR可在20分钟内无扩增检测HBV DNA（20 aM）。

临床应用突破

1. 病毒检测

   • HPV：CRISPR-POC试纸条检测血浆HPV DNA（0.24 fM），成本不足1美元。
   • SARS-CoV-2：STOPCovid.v2通过磁珠富集RNA，30分钟检出临床样本，灵敏度93.1%。
   • 埃博拉病毒：Cas-Roller技术直接检测血清RNA（175拷贝/μL），避免假阳性。

2. 细菌与耐药性监测

   • 结核分枝杆菌：CRISPR-MTB通过LAMP-Cas12a荧光检测，灵敏度媲美Xpert检测。
   • MRSA：RPA-CRISPR/Cas12a侧流层析可在20分钟内可视化耐药基因mecA。
   • 碳青霉烯酶：LAMP-Cas13a平台鉴定OXA-48基因，临床符合率100%。

3. 真菌感染诊断

   • 曲霉菌：RPA-Cas13a双模式检测支气管肺泡灌洗液，灵敏度96.7%。
   • 隐球菌：微流控芯片结合深度学习算法，10分钟区分C. neoformans与C. gattii。

挑战与展望
尽管CRISPR诊断技术展现出巨大潜力，仍面临以下瓶颈：

1. 依赖核酸预扩增，限制检测速度；
2. 复杂样本中基质干扰可能导致假阳性；
3. 资源匮乏地区的基础设施和人员培训不足。

未来发展方向包括：开发免扩增CRISPR传感器、集成微流控芯片实现“样本入-结果出”全自动化、通过国际合作推动技术普惠。正如研究者所言，这项技术不仅将重塑传染病防控体系，更承载着人类对健康公平的共同追求。