靶向人和牛碳酸酐酶的溶剂化变色荧光探针的结构-功能关系研究

研究人员针对可逆性、选择性小分子荧光探针开发中的多重挑战，系统研究了靶向人(hCAII)和牛(bCAII)碳酸酐酶的氨基萘酰亚胺类荧光探针。通过比较80%序列同源但荧光开启响应差异显著的两种酶，结合分子对接技术，揭示了静电作用、疏水效应及空间位阻对探针性能的影响机制，为设计高灵敏度金属酶探针提供了新思路。

　　

碳酸酐酶(CA)作为生物体内调控二氧化碳/碳酸氢盐平衡的关键金属酶，其活性检测对呼吸疾病、肿瘤等研究具有重要意义。然而现有荧光探针普遍存在紫外激发波长不适于活体应用、共价结合不可逆等问题。更棘手的是，即便序列相似度高达80%的同源酶（如人hCAII与牛bCAII），对相同探针的荧光响应也存在巨大差异，这一现象背后的结构机制尚不明确。

美国德克萨斯大学奥斯汀分校的Alyssa R. Malto和Radhika Mehta等研究者，在《Journal of Inorganic Biochemistry》发表的工作中，设计了一套精妙的解决方案。他们构建了以4-N,N-二甲氨基邻苯二甲酰亚胺(4-DMAP)和6-N,N-二甲氨基萘二甲酰亚胺(6-DMN)为核心的溶剂化变色荧光探针库，通过系统改变荧光团、连接臂和金属结合基团(MBG)，结合光谱学分析和PLANTS分子对接技术，首次揭示了二级配位层残基差异如何通过微环境极性变化影响探针的激发态分子内电荷转移(ICT)过程。

关键技术包括：1) 多参数荧光光谱分析（测定K_d
、λ_em
位移等）；2) 计算机辅助分子对接(PLANTS算法)；3) 含吗啉修饰探针的合成与表征。研究特别关注了bCAII特有的Val-131残基形成的疏水口袋对探针DMAP-C2-S荧光量子产率的提升机制。

【研究结果】

1. 探针设计与光物理表征
   通过引入吗啉基团替代传统二甲氨基，使4-DMAP衍生物在水溶液中量子产率提升3倍。其中含乙基连接臂的DMAP-C2-S对bCAII的荧光开启响应达28倍，远高于hCAII的4倍。

2. 结合亲和力差异
   尽管两种酶的催化效率(k_cat
   /K_M
   )相近（hCAII:15×10⁷
   M^-1
   s^-1
   ，bCAII:8.7×10⁷
   M^-1
   s^-1
   ），但探针K_d
   值显示bCAII结合强度普遍高1-2个数量级，分子对接揭示这与bCAII活性中心入口处更大的疏水腔相关。

3. 结构-功能关系
   关键发现是bCAII的Val-131取代了hCAII的Leu-131，形成的扩展疏水区域能更有效抑制探针激发态分子内扭转电荷转移(TICT)的非辐射衰减，这一结论通过发射波长蓝移(λ_em
   降低15nm)得到验证。

【结论与意义】
该研究不仅阐明了物种间微小氨基酸差异如何通过改变活性口袋的静电势分布和疏水性来调控荧光响应，更建立了"二级配位层残基-微环境极性-探针ICT效率"的定量关系模型。所开发的吗啉修饰探针兼具水溶性和高信噪比特性，为活体追踪金属酶动态提供了新工具。这项工作为针对特定蛋白亚型设计精准光学探针提供了范式，对疾病相关CA异构体的选择性检测具有重要转化价值。