对虾六种病毒病原体多重PCR检测技术的建立与应用

针对对虾养殖业中TSV、WSSV、IHHNV/PstDV1、HPV、MBV/PmNV和YHV六种高致病性病毒混合感染难以快速鉴别的问题，浙江大学团队开发了一种高特异性多重PCR方法。该技术可同步检测六种病毒，灵敏度达5×102 -103 copies/μL，与单重PCR符合率>98.5%，为对虾病毒监测提供了经济高效的解决方案。

　　

全球对虾养殖业长期遭受病毒性疾病的威胁，仅病毒性病原导致的年损失就占养殖总量的24%（按文中40%疾病损失中60%为病毒致病计算）。其中白斑综合征病毒(WSSV)可在7天内引发100%死亡率，而传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV/PstDV1)等慢性病原则被世界动物卫生组织(OIE)列为须申报疾病。更棘手的是，集约化养殖中常出现多种病毒共感染，且临床症状相似，传统单重PCR检测成本高昂。虽然Khawsak等曾报道六重检测方法，但灵敏度不足。为此，浙江大学的科研团队在《Journal of Invertebrate Pathology》发表研究，开发了新一代高灵敏度多重PCR技术。

研究团队采用三项关键技术：1）基于病毒保守序列设计特异性引物，确保扩增片段大小差异可区分；2）优化反应体系（如Taq Plus Master Mix浓度、差异化引物浓度梯度）；3）建立55℃退火温度的PCR程序。从杭州萧山围垦区采集的1180份凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)样本，以5尾为单位组成236个混合池进行验证。

【Multiplex PCR assay optimization】
通过调整引物浓度（MBV引物达0.53 μM）、退火温度等参数，实现六种病毒同步扩增。其中MBV因基因组结构复杂，检测限为5×10³
copies/μL，其余五种均达5×10²
copies/μL。

【Discussion】
与单重PCR和实时PCR对比显示，符合率超98.5%。现场检测发现IHHNV阳性率最高（22.88%），WSSV次之（7.2%），印证了该病毒在华东地区的流行态势。特别值得注意的是，该方法成功克服了MBV（Penaeus monodon nudivirus）与HPV的交叉反应难题，这得益于针对杆状病毒科(Baculoviridae)特有基因设计的引物。

该研究的创新性在于：首次建立可同时区分RNA病毒（TSV/YHV）和DNA病毒（如WSSV/MBV）的多重PCR体系，且灵敏度较前人提升10倍。作者王佩等在讨论中指出，该方法适用于养殖场日常监测，单次检测成本仅为传统方法的1/6。研究不仅为对虾病毒防控提供利器，其引物设计策略（如针对WSSV的VP28基因保守区）也为其他水产病原检测技术开发提供了范式。