选择性同位素标记揭示异双金属Mn/Fe蛋白的化学能力与反应机制

研究人员针对R2lox蛋白中酪氨酸-缬氨酸交联形成的争议性机制，通过选择性同位素标记结合多种光谱技术，证实该异双金属Mn/Fe辅因子可激活C?H键，并捕获到高价态MnIV /FeIV 中间体。该研究为理解Mn/Fe辅因子替代Fe/Fe辅因子的功能潜力提供了关键机制依据。

　　

在生物化学领域，非血红素双铁羧酸盐蛋白家族以其多样的氧化反应能力著称，从氧运输到碳氢化合物氧化，这类蛋白几乎参与了所有挑战性生物转化过程。然而，近年来科学家们发现，某些家族成员竟能以锰/铁（Mn/Fe）异双金属辅因子形式发挥作用，这彻底颠覆了传统认知。其中，R2样配体结合氧化酶（R2lox）的表现尤为引人注目——它能在氧气激活时形成独特的酪氨酸-缬氨酸醚交联，但关于这个两电子氧化反应究竟始于酪氨酸O?H键还是缬氨酸C?H键的活化，学界一直争论不休。

俄亥俄州立大学Hannah S. Shafaat团队在《Journal of Inorganic Biochemistry》发表的研究，通过精妙的实验设计揭开了这一谜团。研究人员采用选择性同位素标记结合快速冷冻淬灭电子顺磁共振（EPR）等先进技术，首次捕捉到反应过程中的关键中间体，为理解Mn/Fe辅因子的独特化学能力提供了分子层面的证据。

关键技术方法包括：1）利用缬氨酸营养缺陷型大肠杆菌表达同位素标记蛋白（d₈
V R2lox）；2）通过紫外-可见光谱和低温EPR追踪反应动力学；3）采用快速冷冻淬灭技术捕获瞬态中间体；4）结合质谱分析验证同位素效应。所有实验均使用来自Geobacillus kaustophilus的R2lox蛋白。

【分离金属结合与氧活化步骤解析反应机制】
通过分步金属化和氧活化策略，研究人员成功解耦了传统实验中相互干扰的金属结合动力学与O₂
活化过程。时间分辨光谱发现，反应先后经历620 nm特征吸收的瞬态中间体（I₁
）和后续的EPR沉默物种（I₂
），最终形成具有特征g=2信号的Mn^IV
/Fe^IV
中间体。这种分步策略首次清晰揭示了R2lox活化氧气的完整路径。

【同位素标记揭示C?H键活化的决定性作用】
通过比较普通溶剂与氘代缬氨酸（d₈
V）标记蛋白的反应动力学，发现两者均呈现约2的同位素效应，证明C?H键活化是决速步骤。质谱分析进一步证实，反应涉及缬氨酸C?H键的直接断裂，而非先前假设的酪氨酸O?H优先活化机制。

【高自旋中间体的结构特征】
EPR检测到的Mn^IV
/Fe^IV
物种表现出与Ic类核糖核苷酸还原酶（RNR）相似的信号特征，但具有更显著的零场分裂参数。理论计算表明，这种差异源于R2lox活性位点独特的氢键网络，该网络通过质子耦合方式显著降低了C?H键活化能垒。

这项研究不仅阐明了R2lox催化缬氨酸C?H键活化的分子机制，更重要的是建立了Mn/Fe辅因子活化惰性C?H键的能量下限（BDFE）。发现的Mn^IV
/Fe^IV
中间体为理解异双金属辅因子的氧化能力提供了直接光谱证据，其与Ic类RNR的相似性暗示这类辅因子可能在进化中被广泛用于替代传统Fe/Fe中心。该成果为设计新型生物催化剂开辟了道路，特别是在需要选择性C?H官能团化的合成生物学应用中。论文最后指出，鉴于目前许多注释为Fe/Fe的蛋白可能实际采用Mn/Fe辅因子，未来需要重新评估这类蛋白的金属需求与催化机制。