重组酶辅助扩增技术结合实时荧光与侧流层析法快速检测胸膜肺炎放线杆菌

本研究针对猪传染性胸膜肺炎（PCP）病原体胸膜肺炎放线杆菌（A. pleuropneumoniae）的快速检测需求，开发了基于apxIVA基因保守区的重组酶辅助扩增（RAA）技术，包括实时荧光（real-time RAA）、可视化（visual RAA）及侧流层析（RAA-LFD）三种检测方法。结果显示，这些方法可检测所有血清型，灵敏度达17.9-203.5 copies μL-1 ，与qPCR一致性达97.6%-100%，为现场诊断提供了高特异性、高灵敏度的解决方案。

　　

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, A. pleuropneumoniae）引发的重大细菌性传染病，每年给全球养猪业造成数十亿美元损失。尽管现有PCR等技术可用于检测，但其依赖昂贵设备和复杂操作流程，难以在基层养殖场推广。更棘手的是，该病原体存在15种血清型，传统方法难以全覆盖检测。如何实现快速、便携且覆盖全血清型的诊断，成为防控PCP的关键瓶颈。

针对这一挑战，中国农业科学院的研究团队基于apxIVA基因保守区，创新性地将重组酶辅助扩增（Recombinase-aided amplification, RAA）技术与多重检测平台结合，开发了三种新型检测方法：通过实时荧光（real-time RAA）实现实验室精准定量，借助便携蓝光仪（visual RAA）完成现场可视化判读，利用侧流层析试纸条（RAA-LFD）实现无需仪器的快速检测。

关键技术包括：1）针对apxIVA基因设计特异性引物和exo/nfo探针；2）优化RAA反应体系实现常温扩增；3）临床样本验证采用qPCR作为金标准对比。

研究结果显示：

1. 特异性验证：所有检测方法均能识别15种血清型A. pleuropneumoniae，且与猪肺炎支原体等常见病原无交叉反应。
2. 灵敏度比较：real-time RAA与RAA-LFD的检测下限达17.9 copies μL^-1
   （95% CI），visual RAA为203.5 copies μL^-1
   。
3. 临床符合率：对127份临床样本检测显示，real-time RAA与qPCR符合率97.6%，另两种方法达100%。

讨论指出，该研究首次将RAA技术应用于A. pleuropneumoniae全血清型检测，突破传统方法对热循环仪的依赖。visual RAA和RAA-LFD尤其适合资源有限地区，其操作时间仅20分钟，成本不足常规PCR的1/3。值得注意的是，apxIVA基因的选择保障了检测覆盖度，因其在所有血清型中高度保守且参与病原体毒力机制。

这项发表于《Journal of Integrative Agriculture》的研究，为PCP防控提供了革命性工具。三种方法形成梯度检测方案：real-time RAA适用于实验室精准分析，后两者可嵌入养殖场日常监测系统。未来若结合智能手机图像分析，有望进一步推动兽医诊断技术的数字化变革。