揭示小麦Ec-1金属硫蛋白βE 结构域的金属化路径：ZnII 结合与蛋白质折叠机制的新见解

研究人员针对植物金属硫蛋白（MTs）中独特的βE -Ec -1结构域金属化路径不明的问题，通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）和半胱氨酸修饰技术，揭示了其优先结合ZnII 的单核位点（ZnCys2 His2 ）及三核簇（Zn3 Cys9 ）的协同与非协同结合机制，为理解植物MTs的金属稳态功能提供了新视角。

　　

金属硫蛋白（Metallothioneins, MTs）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白，能够特异性结合Zn^II
、Cu^I
等d¹⁰
金属离子，在金属离子稳态和解毒过程中发挥关键作用。尽管动物MTs的结构和功能已被广泛研究，植物MTs的金属化机制仍是一大谜团。小麦Ec-1作为首个被解析三维结构的植物MT，其β_E
结构域包含一个独特的单核ZnCys₂
His₂
位点（类似锌指结构）和一个三核Zn₃
Cys₉
簇（类似脊椎动物MTs的β簇），但此前仅知其完全金属化状态的结构。这一领域的关键问题在于：金属离子如何逐步结合？不同位点的结合顺序如何影响蛋白质折叠？这些问题的解答将揭示植物MTs在种子发育和金属储存中的生理功能。

为阐明这一机制，研究人员综合运用核磁共振（NMR）光谱、质谱（MS）和靶向半胱氨酸修饰技术，系统分析了β_E
-E_c
-1结构域在逐步金属化过程中的结构变化。

3.1. 通过[¹³
C,¹
H]-HSQC光谱评估单核位点的Zn^II
结合
研究发现，单核ZnCys_{2
His2
位点对Zn^II
的结合具有优先性。通过监测组氨酸残基的化学位移变化，确认首个Zn^II
优先占据单核位点，且该位点的金属化独立于三核簇的折叠状态。}

3.2. ESI-MS、HSQC和模拟分析的协同性验证
质谱数据显示，金属化过程并非完全协同：首个Zn^II
非协同结合至单核位点后，后续Zn^II
添加表现出部分协同性。统计模拟进一步支持这一混合机制。

3.3. 半胱氨酸修饰与Zn^II
结合位点定位
双标记实验（IAM/NEM）证实，单核位点的两个半胱氨酸在早期金属化中被修饰，而三核簇的半胱氨酸则随Zn^II
增加逐步参与配位，印证了分步金属化路径。

3.4. 金属化路径对结构的依赖性
动态光散射（DLS）和扩散排序光谱（DOSY）显示，首个Zn^II
结合触发蛋白质构象紧缩，但后续金属化导致轻微扩张，表明单核位点可能作为结构“脚手架”引导三核簇形成。

这项研究首次揭示了小麦Ec-1 β_E
结构域的金属化路径：Zn^II
优先结合单核ZnCys₂
His₂
位点，随后通过协同与非协同混合机制填充三核Zn₃
Cys₉
簇。这一发现不仅阐明了植物MTs独特的金属结合策略，还为其在种子锌储存和胚胎发育中的功能提供了分子基础。未来研究可进一步探索单核位点的特异性功能，例如是否参与转录调控或其他信号传递过程。论文发表于《Journal of Inorganic Biochemistry》，为植物金属生物学领域树立了新的里程碑。