综述：国际液体活检协会(ISLB)关于实体瘤循环肿瘤DNA(ctDNA)检测最低要求的共识

这篇综述由国际液体活检协会(ISLB)质量控制和认证委员会主导，系统阐述了ctDNA检测在实体瘤临床应用中的标准化要求。文章从分析前（血液采集管选择/离心条件）、分析中（dPCR/NGS技术选择）到分析后（变异解读/报告规范）三阶段提出共识建议，特别强调MRD检测需超灵敏技术（如UMI校正测序）和8-20mL大体积血浆要求，为全球实验室建立LDTs提供了首个系统性质量控制框架。

　　

1. 引言
循环肿瘤DNA(ctDNA)检测正重塑精准肿瘤学格局，这种液态活检技术通过捕捉血液中肿瘤释放的DNA片段，实现无创性突变检测和微残留病灶(MRD)监控。与传统组织活检相比，ctDNA能动态反映肿瘤异质性和进化过程，特别是在评估靶向治疗耐药机制方面具有独特优势。然而不同实验室报告的敏感度差异高达30%，凸显标准化建设的紧迫性。

2. 预分析关键环节
2.1 血液采集规范
使用蝶形针头可减少剪切力导致的溶血，采集后需立即轻柔颠倒混匀。值得注意的是，血浆比血清更适合ctDNA分析——血清因凝血过程释放大量白细胞DNA，可能稀释低频突变信号。

2.2 采血管选择
常规EDTA管需在4小时内完成血浆分离，而专用cfDNA稳定管(如Streck BCT)可将保存期延长至14天。但需注意：这类稳定剂可能影响循环肿瘤细胞(CTC)的后续分析。

2.3 离心方案
推荐两阶段离心法：首次800g去除细胞成分，后续16,000g清除微粒。对于MRD检测这类超灵敏应用，至少需要8mL血浆（相当于2管10mL全血），而常规检测4mL即可满足。

2.4 cfDNA提取技术
比较研究发现，QIAGEN QIAamp CNA试剂盒回收率最高，但Maxwell AX1115系统在Streck管样本中表现更稳定。自动化提取平台能降低操作者间变异，尤其适合大通量实验室。

3. 分析阶段核心技术
3.1 方法学选择
• MRD检测：需肿瘤知情(tumor-informed)策略，采用UMI标记的NGS或ddPCR，检测限需达0.01% VAF
• 靶向治疗：热点突变panel（如EGFR^T790M
）首选dPCR，成本效益比最优
• 全景分析：150-300基因杂交捕获测序可平衡深度与广度

3.2 验证要点
使用梯度稀释参考物质（如Horizon标准品）验证检测限(LOD)，对于1% VAF突变需达到95%检出率。值得注意的是，阴性报告应注明肿瘤分数(TF)评估结果，避免假阴性误导临床。

4. 质量体系构建
FDA新规要求LDTs需在2027年前完成IVDR认证，ISO 15189:2022新增对ctDNA片段分析的质量指标。建议实验室参与EMQN室间质评，并建立内部质控：
• 每批次包含阴性对照和0.1%/1% VAF标准品
• 监测cfDNA片段分布（主峰应位于167bp）

5. 未来展望
随着IVDR和FDA新规实施，ctDNA检测将逐步从科研走向临床常规。甲基化特征分析和片段组学(fragmentomics)等新维度，有望进一步提升早期癌症筛查灵敏度。ISLB建议通过多中心比对试验，逐步建立不同癌种的特异性cut-off值。