利用15 N CEST NMR技术解析蛋白质可见态间慢交换动力学的新策略

本研究针对传统二维1 HN –15 N ZZ交换实验中交叉峰重叠问题，创新性采用15 N CEST（化学交换饱和转移）技术，以T4溶菌酶T34A突变体为模型，成功量化了天然态（21%占比）与次要态间5 s?1 的交换速率，为蛋白质动态研究提供了高分辨率解决方案。

　　

蛋白质构象动态研究是理解其功能机制的核心。传统核磁共振技术中，二维¹
H^N
–¹⁵
N ZZ交换实验虽能捕捉蛋白质可见态（>10%占比，寿命>50 ms）间的慢交换（1-20 s^?1
），但交叉峰重叠问题严重制约解析精度，尤其在¹
H^N
化学位移相近时需耗时三维实验。更棘手的是，现有¹⁵
N CEST技术多聚焦于"不可见态"研究，对可见态交换的适用性尚未系统验证。

针对这些瓶颈，TIFR Hyderabad的研究团队提出创新方案：利用单次高场¹⁵
N CEST实验同步获取蛋白质双态磁化转移信息。以18 kDa的T34A T4溶菌酶为模型（40°C下天然态与21%占比次要态交换），通过7.9 Hz强B
₁
场结合450 ms交换期，成功从Y18等五个位点的双态CEST曲线中提取出k_ex
≈5 s^?1
的精确参数，与ZZ交换实验结果高度一致。该成果发表于《Journal of Magnetic Resonance》，为蛋白质动态研究开辟了新路径。

关键技术包括：1）¹⁵
N CEST脉冲序列优化，实现双态磁化同步检测；2）高场（B
₁

1.25(k_ex
(k_ex
+R_2,max
))^1/2
）快速采集策略；3）基于ChemEx软件的双态联合拟合；4）¹
H^N
–¹⁵
N ZZ交换交叉验证。样本为1 mM ¹⁵
N标记T34A T4L（pH 5.5磷酸缓冲液），避免D₂
O导致的H/D交换干扰。

结果与讨论

1. 谱峰分离难题突破：在T21和A41位点，当双态¹
   H^N
   位移差<0.02 ppm时，传统ZZ交换实验失效。而CEST通过¹⁵
   N维单频照射（图1A），成功区分δ_B
   ^N
   -δ_A
   ^N
   达0.5 ppm的微小差异，避免三维实验需求。

2. 双态参数协同解析：联合分析A态（δ_A
   ^N
   处主谷）和B态（δ_B
   ^N
   处主谷）的CEST曲线（图2），发现当ω₁
   /2π=7.9 Hz时，次要态检测灵敏度提升3倍。通过初始磁化（M?(0)）或p_B
   的独立校准（式1），使k_AB
   与k_BA
   误差<10%。

3. 生物学意义揭示：次要态构象变化集中于β3-α2连接区（类似WT*的"B态"），CEST数据表明该动态模块可能参与底物识别。相比R₁
   /R₂
   弛豫分散，该方法对R₂
   差异>5 s^?1
   的体系更具优势。

结论
该研究确立了¹⁵
N CEST在可见态交换研究中的普适性：1）规避交叉峰重叠，将实验维度从3D降为2D；2）单次高场实验即可获取k_ex
和p_B
；3）对¹
H^N
位移退化体系仍有效。未来可拓展至多态交换体系及药物结合动力学研究，为蛋白质动态景观绘制提供强有力工具。Nihar Pradeep Khandave等的工作标志着生物NMR方法学的重要进展。