基于刃天青荧光实时监测支原体生长的快速可靠低成本方法研究

为解决支原体(Mycoplasma spp.)生长监测中传统方法耗时、操作繁琐且无法区分活/死细胞的问题，研究人员开发了基于刃天青(Resazurin)荧光还原的实时检测技术。通过qPCR仪连续监测荧光信号(520/555 nm)，24小时内即可获得与MPN法高度一致的生长曲线，并能快速区分温度敏感突变株。该方法为支原体基础研究和疫苗开发提供了高效工具。

　　

支原体作为最小的自我复制原核生物，其独特的生物学特性给研究带来巨大挑战。这类缺乏细胞壁的微生物生长缓慢，在液体培养基中不产生明显浊度，传统的光密度(OD₆₀₀
)检测完全失效。目前监测支原体生长主要依赖最可能数(MPN)滴定或菌落计数(CFU)，前者需观察pH指示剂颜色变化耗时数周，后者需显微镜观察微小菌落且精度有限。更棘手的是，现有方法无法区分活菌与死菌，对非产酸菌株(如M. gallinarum)完全无效，严重制约了支原体相关研究和疫苗开发。

针对这一技术瓶颈，墨尔本大学的研究团队创新性地将刃天青荧光检测技术应用于支原体研究。刃天青作为无毒氧化还原指示剂，可被活细胞代谢还原为粉红色荧光产物试卤灵(Resorufin)，这一特性已被广泛用于真核和原核细胞的活力检测。研究人员将2.5 mg/L刃天青直接加入支原体培养基(MB-RZ)，利用qPCR仪兼具的温控和荧光检测功能(激发520 nm/发射555 nm)，每5分钟自动记录一次信号，实现了对M. synoviae、M. gallisepticum等四种支原体的全程无干预监测。相关成果发表在《Journal of Microbiological Methods》上，为支原体研究提供了革命性工具。

关键技术包括：1) 使用qPCR仪同步实现37°C恒温培养和荧光监测；2) 建立刃天青浓度梯度优化体系(2.5 mg/L)；3) 平行进行MPN滴定验证(每2小时取样)；4) 应用Growthcurver软件进行生长曲线分析。所有菌株来自亚太动物健康中心收藏或疫苗生产商。

研究结果方面：
3.1 qPCR仪成功捕获典型生长曲线
M. synoviae 7NS的荧光信号呈现"S"型曲线，与对数期、平台期完美对应。三种接种浓度(1:20-1:80稀释)显示初始菌量与t-mid值(达50%最大荧光时间)呈负相关，技术重复性优异。背景扣除后曲线形态改变但关键参数(如μ-max 0.3-0.6 h^-1
)保持稳定。

3.2 广谱适用性与MPN法高度一致
四种支原体均产生特征性荧光曲线，其中M. gallisepticum AP3AS和M. gallinaceum增速最快(μ-max 2.24-3.11 h^-1
)。与MPN结果的Spearman相关系数达0.902-0.963。特别值得注意的是，该方法首次实现了对非发酵型M. gallinarum的生长监测，填补了技术空白。

3.3 精准鉴别温度敏感表型
对疫苗株MS-H(M. synoviae)和ts-11(M. gallisepticum)的检测显示，在非许可温度(39°C)下突变株μ-max显著降低(MS-H从0.88降至0.34 h^-1
)，而野生型7NS和AP3AS保持稳定。MPN验证显示突变株在39°C时滴度降低100倍，与荧光数据高度吻合。

讨论部分指出，该方法突破性地将检测时间从数周缩短至24小时，且成本仅为传统方法的1/10。2.5 mg/L的刃天青浓度远低于支原体抑制阈值(文献报告M. gallisepticum耐受38.9 mg/L)，活菌平板验证证实无毒性影响。虽然荧光信号在平台期后出现下降(可能与二氢试卤灵形成有关)，但关键生长参数仍可准确获取。对于温度敏感疫苗株的快速鉴别，该方法相比分子检测更经济，比传统表型分析更精准，有望成为疫苗质控新标准。

这项研究不仅建立了首个支原体实时生长监测通用方案，其创新性的"qPCR仪复用"策略更为小型实验室提供了高端替代方案。未来可进一步优化培养基成分减少背景干扰，并探索在抗菌药物敏感性测试等领域的应用潜力。随着技术推广，这套简便可靠的系统或将重塑支原体研究方法学范式。