丝状真菌药敏检测新方法DAFFS的建立及其在抗真菌药物筛选中的应用

针对丝状真菌药敏检测方法存在标准化不足、结果变异大等问题，Lawrence Livermore国家实验室团队开发了新型Disk diffusion Assay for Filamentous Fungi Susceptibility（DAFFS）方法。该研究整合EUCAST和CLSI标准，通过优化琼脂扩散实验，成功实现对Trichoderma asperellum等3种致病性丝状真菌的Caspofungin和Amphotericin B药敏检测，为临床抗真菌药物筛选提供新工具。

　　

随着全球变暖加速真菌适应性进化，丝状真菌对人类健康的威胁日益加剧。据统计，真菌感染已导致全球每年160万人死亡，其中丝状真菌如Trichoderma asperellum等新兴病原体因缺乏标准化药敏检测方法，临床治疗面临严峻挑战。现有欧洲抗菌药敏试验委员会（EUCAST）和美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的方法仅适用于酵母和曲霉菌，对多数丝状真菌存在检测周期长、结果变异大等问题。Lawrence Livermore国家实验室的研究团队在《Journal of Microbiological Methods》发表研究，开发了创新性的Disk diffusion Assay for Filamentous Fungi Susceptibility（DAFFS）方法。

研究团队采用RPMI 1640琼脂培养基，通过优化真菌悬液制备（含1-2×10⁷
spores/mL的过滤菌悬液）、药物剂量设计（基于文献MIC值5倍换算）和扩散盘布局（四象限等距放置），建立标准化操作流程。针对Trichoderma asperellum（环境分离株）、Talaromyces marneffei（ATCC 18224D-2）和Lichtheimia ramosa（ATCC 22754）三种典型病原体，分别设置2.5-640 μg梯度浓度的Caspofungin和Amphotericin B药物盘，通过ImageJ量化生长抑制半径。

【3.1 Caspofungin抗真菌实验结果】显示：40 μg剂量对T. asperellum产生0.97±0.13 cm抑制带，160 μg对T. marneffei抑制达0.93±0.01 cm。值得注意的是，T. marneffei在药物作用区出现特征性红色应激色素，与文献报道的抗真菌压力响应机制一致。

【3.2 Amphotericin B抗真菌研究】发现：640 μg剂量对L. ramosa抑制半径为0.60±0.06 cm，而T. asperellum在相同剂量下仅显示0.48±0.02 cm抑制带，反映不同菌种对多烯类药物的敏感性差异。补充实验证实，初始设计的2.5 μg Amphotericin B剂量因低于临界阈值未能产生抑制效应，凸显剂量优化的重要性。

讨论部分指出，DAFFS方法创新性地利用丝状真菌的径向生长特性，克服传统孢子悬液铺板导致的过度生长问题。相比微孔板稀释法，该方法可单板测试6种化合物，成本降低80%。但作者强调，对于生长不对称的菌株需增加重复样本，且需考虑药物稳定性问题——如Caspofungin在30°C条件下11天仍保持活性，但更长周期可能需要二次给药。

该研究的临床意义在于为WHO重点监测的Talaromyces marneffei等中高风险病原体提供新的药筛工具。未来通过纳入更多菌株验证和建立判读标准，DAFFS有望成为非曲霉属丝状真菌AFST的标准方法之一，对应对气候变化引发的真菌耐药性危机具有重要价值。