乙二醛作为新型固定剂在小鼠心脏组织中提升抗原性和结构完整性的优势研究

本研究针对传统甲醛类固定剂（如4% PFA）在免疫荧光(IF)和交联免疫沉淀-质谱(xIP-MS)应用中存在的过度交联、抗原性破坏等问题，系统评估了二碳二醛化合物乙二醛(glyoxal)作为替代固定剂在小鼠心脏组织中的应用效果。通过组织学染色、多重免疫荧光和蛋白质组学分析，证实3%乙二醛能更好地保持心肌组织结构，显著提升SR、ICD和肌节蛋白的抗原性，并成功应用于心脏蛋白质互作网络研究，为心脏生物化学研究提供了更优的固定方案。

　　

在心血管研究领域，组织样本的固定处理一直是影响实验结果可靠性的关键环节。传统甲醛类固定剂如4%对甲醛(PFA)虽被广泛使用，却存在明显缺陷：过度交联导致抗原表位掩蔽、组织脆性增加，以及难以平衡结构保存与分子可及性的矛盾。特别是在富含蛋白质的心肌组织中，这些问题更为突出——肌浆网(SR)蛋白如受磷蛋白(PLN)和肌浆网钙ATP酶(SERCA2)的异常定位，闰盘(ICD)处连接蛋白N-钙黏蛋白(N-Cadherin)和连接蛋白43(Cx43)的信号丢失，都严重制约着心脏超微结构研究的准确性。更棘手的是，现有固定方法难以同时满足组织形态学、蛋白质互作研究和深度成像的多重要求，这使得寻找新型固定剂成为亟待解决的课题。

针对这一系列挑战，多伦多大学的研究团队在《Journal of Molecular and Cellular Cardiology Plus》发表了一项创新性研究。研究人员系统比较了不同浓度乙二醛(1-9%)及其复合配方对小鼠心脏组织的固定效果，通过组织学、多重免疫荧光、蛋白质溶解性分析和交联免疫沉淀-质谱联用技术(xIP-MS)，全面评估了这一二醛化合物在心脏研究中的应用价值。研究不仅证实了乙二醛在保持组织形态上的优势，更揭示了其在提升抗原检测灵敏度和蛋白质复合物保存方面的独特价值。

关键技术方法包括：(1)建立5种乙二醛固定方案(3%纯乙二醛、含乙醇/乙酸等复合配方)；(2)采用H&E染色和图像定量分析评估心肌纤维完整性；(3)通过共聚焦显微镜对SR、ICD和肌节标志物进行三维成像；(4)开发30μm厚片抗体穿透性评估体系；(5)建立乙二醛固定心脏组织的PLN互作组xIP-MS分析流程。所有实验均以4% PFA为对照，使用6-8周龄C57BL/6J小鼠心脏样本。

研究结果部分：

3.1 乙二醛对心脏结构的影响评估
通过H&E染色定量分析发现，3%乙二醛与4% PFA对心肌纤维结构的保存效果相当，而高浓度乙二醛(9%)会导致明显收缩和肌纤维间空隙增大。定量显示9%乙二醛/8%乙酸组的嗜酸性区域比PFA组减少26.82%，证实低浓度乙二醛更适合心脏组织固定。

3.2 SR免疫染色效果
乙二醛显著改善了SR蛋白PLN和SERCA2的定位特异性。与PFA固定产生的质膜假阳性信号不同，乙二醛组显示出清晰的纵向和横向SR染色模式。信号噪声比分析显示3%乙二醛组的SERCA2和PLN信噪比分别达2.13和1.68，显著优于PFA组的1.16和1.15。

3.3 ICD免疫染色优化
在ICD结构成像中，乙二醛实现了N-Cadherin与Cx43的空间分辨，准确反映了两者在闰盘中的解剖位置关系。而PFA固定导致信号弥散，3%乙二醛组的N-Cad信噪比达3.41，是对照组的1.56倍。

3.4 肌节蛋白染色增强
肌球蛋白重链(MyHC)和F-肌动蛋白的染色显示，乙二醛消除了PFA常见的质膜假象，肌节条纹对比度提升2.21倍。计算机辅助分析显示3%乙二醛组的肌节组织评分最高(0.227)，表明其更好地保持了收缩单元的有序性。

3.5 抗体穿透性提升
在30μm厚切片中，乙二醛固定组织的MyHC信号在6.3μm深度仍保持51.3%强度，而PFA组在3.12μm即衰减至52.7%。正交平面成像显示乙二醛组的信号分布更均匀，证实其交联度更适合抗体渗透。

3.6 心脏驻留细胞染色
对平滑肌细胞(SMA)、成纤维细胞(POSTN)和神经细胞(TUJ1)的染色显示，乙二醛使TUJ1信号增强7.87倍，CD31信号提升12%，证实其对非心肌细胞同样具有兼容性。

3.7 蛋白质溶解性特征
溶解性分析揭示乙二醛固定后仍有59.6-66.8%蛋白保持可溶状态，而PFA组仅8.8-20.5%。免疫印迹显示不同蛋白受影响程度各异：PLN在2%乙二醛中增加，而SERCA2普遍减少，说明乙二醛对蛋白的交叉连接具有选择性。

3.8 xIP-MS应用验证
以PLN为靶点的互作组研究鉴定出412种蛋白，其中89种在乙二醛固定组特异性富集，包括整合素β1(ITGB1)和磷酸受纳蛋白等已知互作伙伴。PCA分析显示固定与未固定样本明显分离，证实乙二醛成功保存了天然互作网络。

研究结论与讨论部分指出，3%乙二醛在多个维度超越传统PFA固定：(1)组织结构保存方面，避免高浓度导致的收缩变形；(2)分子检测层面，提升抗体穿透性和抗原表位可及性；(3)技术兼容性上，支持从免疫荧光到蛋白质组学的多组学分析。特别值得注意的是，乙二醛消除了PFA固定导致的质膜假象，这一发现解决了长期困扰心肌免疫定位研究的难题。在xIP-MS应用中，乙二醛的温和交联特性既保留了蛋白质相互作用，又避免了甲醛导致的不可逆聚集，为组织水平互作组学研究开辟了新途径。

该研究的创新价值在于：首次系统评估乙二醛在心脏研究的适用性，建立标准化流程；揭示二醛化合物对肌节、SR和ICD等特殊结构的保存优势；开发出兼容厚组织成像和蛋白质组学的一体化方案。这些发现不仅为心脏研究提供了更优的技术选择，其"适度交联"的理念也可能启发其他器官系统的固定方法优化。未来研究可进一步探索乙二醛在病理标本、人类组织及电镜样本中的应用潜力，并深入解析其选择性交联的分子机制。