胸膜肺炎放线杆菌分子血清分型方法的比较及诊断中非典型血清型的分析研究

推荐：本研究针对猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清分型结果不一致或不可分型的难题，比较了基于荚膜基因（cps）和毒素基因（apx）的两种PCR分型方法在170株菌株中的应用。研究发现37%的临床菌株存在毒素谱与荚膜基因分型不匹配现象，并通过全基因组测序（WGS）揭示了非典型菌株的基因变异机制。该研究为优化APP诊断策略和疫苗开发提供了重要依据，成果发表于《Journal of Microbiological Methods》。

　　

猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是引发猪传染性胸膜肺炎的病原体，尽管已有商业疫苗，但其临床和亚临床感染仍对全球养猪业造成重大损失。当前防控的难点在于：传统血清分型方法存在局限性，部分菌株因基因变异导致分型失败或结果矛盾，而毒素基因（apx）与荚膜基因（cps）的匹配关系尚不明确。这些问题直接影响疫苗选择和抗生素合理使用，亟需建立更精准的分型策略。

针对这一挑战，来自国内某研究机构的研究团队在《Journal of Microbiological Methods》发表论文，系统比较了基于cps基因和apx毒素基因的两种PCR分型方法，并结合全基因组测序（WGS）解析非典型菌株的遗传特征。研究团队分析了151株临床分离株和19株参考菌株，通过MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）鉴定菌种后，并行开展两种分子分型，对矛盾结果进行WGS验证。

关键技术方法
研究采用改良的毒素基因PCR（靶向apxIA-IB-II-III-IV）和多重荚膜基因PCR（覆盖19种血清型），通过毛细管电泳分析产物；对非典型菌株进行纳米孔测序（Oxford Nanopore），使用Flye组装和Medaka抛光基因组，通过Tandem Repeat Finder分析串联重复序列。

研究结果

3.1 毒素基因分型结果
19株（12.6%）临床分离株因毒素谱模糊无法明确分型，其中5株同时匹配7/12/13型，14株在1/5/9/11型间交叉。

3.2 荚膜基因分型结果
12株（8%）临床分离株无法通过cps-PCR分型，包括2株同时检出2型和8型信号，10株完全无扩增。

3.3 分型方法差异分析
55株（36.7%）被定义为非典型菌株，分为两类：

1. 非典型cps基因型（AT-CPS，n=12）：WGS证实7株为新型血清型（如18/19型），2株cps-2/8混合信号实为2型；
2. 非典型apxIV长度（AT-apxIV，n=43）：19株cps-6型菌株携带2800 bp的apxIV（标准为2000 bp），WGS显示其序列更接近2/8/15型，差异源于825 bp的串联重复序列。

基因缺失的解决方案
4株cps-不可分型的9/11型菌株中，3株在cpsF基因3′端存在400-600 bp缺失，覆盖原PCR引物结合位点。团队设计新反向引物（Ap9Rmod），将产物从1758 bp缩短至安全区域，验证后成功应用于临床检测。

讨论与意义
该研究首次系统揭示APP临床分离株中36.7%存在分型异常，突破性发现包括：

1. 毒素基因的临床价值：apxI-III谱高度保守，可作为毒力标志，而apxIV因串联重复变异频繁，需谨慎解读；
2. 诊断标准优化：提出"APP cps型2，apx基因谱apxIB/apxII/apxIII"的标准化报告格式，兼顾血清型与毒力特征；
3. 技术革新：针对cpsF缺失设计的引物方案，解决了9/11型漏检问题，已整合至常规诊断流程。

研究为APP的精准防控提供了分子基础：疫苗开发需同时考虑cps型别和毒素谱，而WGS将成为疑难菌株分型的金标准。随着血清型增至19种，这种多方法联检策略对追踪病原进化、指导区域化防控具有重要实践意义。