纽约州临床实验室评估计划下新一代测序检测的全面验证：RPPH检测在造血系统肿瘤分子诊断中的应用与合规路径

本研究针对美国FDA将实验室自建检测(LDTs)纳入体外诊断(IVD)监管引发的实施难题，以纽约州卫生部临床实验室评估计划(CLEP)为框架，系统验证了RPPH检测——一种靶向400+基因的NGS panel在造血系统肿瘤中的分析性能。研究通过建立标准化操作流程、质量控制指标和六阶段验证体系（涵盖准确性、精密度和临床报告规范），证实RPPH对SNV、indel和融合基因的检测灵敏度达VAF≥5%（FLT3-ITD达1%），为实验室获取NYS CLEP批准提供了可复制的技术路线图。

　　

随着精准医疗时代的到来，新一代测序(NGS)技术在肿瘤分子诊断中扮演着越来越重要的角色。然而，如何确保这些复杂的实验室自建检测(LDTs)在临床实践中的准确性和可靠性，成为全球监管机构面临的重大挑战。美国食品药品监督管理局(FDA)近期决定将LDTs纳入体外诊断(IVD)监管范畴，这一政策转变在业内引发了广泛讨论和担忧。在此背景下，纽约州卫生部通过其临床实验室评估计划(CLEP)建立了一套严格的NGS检测评估体系，但相关验证流程在同行评议文献中仍缺乏详细描述。

造血系统肿瘤的分子特征复杂多样，涉及数百种基因变异，包括单核苷酸变异(SNV)、插入缺失(indel)和融合基因等。这些变异不仅对疾病分类和预后分层至关重要，更是靶向治疗选择的关键依据。例如，FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)和NPM1突变状态直接影响急性髓系白血病(AML)患者的风险分层和治疗决策。然而，传统的单基因检测方法效率低下，无法满足临床对全面分子谱分析的需求。因此，开发符合监管要求的高通量NGS检测平台，成为解决这一临床痛点的必然选择。

Roswell Park综合癌症中心的研究团队针对这一需求，开发了名为Rapid Pan-Heme (RPPH)的综合性NGS检测panel。该检测整合了DNA和RNA双组分分析：DNA组分采用定制杂交捕获panel覆盖347个血液肿瘤相关基因，可检测SNV和indel；RNA组分则通过Archer FusionPlex Pan-Heme Panel分析72个融合基因。为满足纽约州CLEP的审批要求，研究人员系统性地开展了六阶段验证研究，包括建立标准操作流程、定义质量控制指标、设置运行对照、验证分析准确性、评估精密度和可重复性，以及制定临床报告规范。

关键技术方法包括：1) 使用Qiagen和Covaris试剂盒进行DNA/RNA提取；2) 采用Agilent Magnis NGS Prep System和Archer FusionPlex Protocol分别构建DNA和RNA文库；3) Illumina NextSeq平台进行双端测序；4) 通过GATK Mutect2和ScanITD算法进行变异检测；5) 使用Sanger测序对SNV/indel进行正交验证；6) 临床样本来源于Roswell Park临床档案库的168例血液肿瘤患者。

研究结果部分，通过六个关键实验系统验证了RPPH的性能：

建立运行对照要求：定义了无模板对照(NTC)和阳性对照(PC)的质控阈值。DNA检测中NTC的reads数阈值设为<77,043，PC需检出≥80%预期变异；RNA检测中NTC的片段数阈值<185,000，PC需100%检出融合基因。

批次效应研究：在模拟临床样本量(1-21样本/批次)条件下，RPPH对VAF≥5%的SNV和indel检出一致性达100%，但对VAF<5%的变异灵敏度有限。融合基因检测在RNA单独运行时保持稳定。

分析灵敏度验证：通过梯度稀释实验确定检测下限。SNV在VAF≥20%时100%检出至12.5%稀释度；indel在VAF 5-20%范围内50%稀释度后检出率下降；融合基因在25%稀释度下保持100%检出率。

分析有效性验证：正交验证显示，268个SNV的Sanger确认率为98.1%，159个indel中FLT3-ITD与毛细管电泳结果一致性达94.1%，43例融合基因检测全部与金标准吻合。

精密度与可重复性：SNV的批内和批间变异系数分别<1%和<5%；indel在VAF>5%时批间一致性>91%；融合基因在不同操作条件下的检出稳定性达100%。

报告规范制定：按照CLEP要求设计临床报告模板，将变异分为3个临床证据等级，并明确检测局限性（如最低检出VAF为5%，FLT3-ITD为1%）。

这项发表在《The Journal of Molecular Diagnostics》的研究具有多重意义：首先，RPPH作为首个全面遵循NYS CLEP标准验证的血液肿瘤NGS panel，其347个DNA基因和72个RNA融合的检测范围远超常规临床检测；其次，研究建立的六阶段验证框架为其他实验室获取监管批准提供了可复制的技术路线；更重要的是，该检测实现了对AML风险分层关键标志物（如FLT3-ITD、NPM1、CEBPA等）的一次性全面评估，将传统需要多平台完成的检测整合至单一流程。

研究者特别指出，虽然RPPH对VAF<5%的变异灵敏度有限，但这与多数临床决策阈值（如FLT3-ITD的1%）相匹配。值得注意的是，该研究也存在一定局限：如FLT3-ITD的0.4 VAF阈值是基于早期临床实践设定，与当前ELN指南有所差异；此外，检测尚未涵盖拷贝数变异等基因异常类型。

这项研究不仅证实了RPPH作为血液肿瘤分子诊断工具的可靠性，更重要的是为NGS技术在临床转化中的监管合规性提供了标杆式案例。随着FDA对LDTs监管的逐步加强，这类系统性的验证研究将为分子诊断领域的规范化发展奠定重要基础。未来，整合更多变异类型检测和定期软件升级验证将成为进一步优化方向。