基于GeoMx DSP技术的人脑FFPE组织层状特异性锥体神经元空间转录组分析新策略

推荐：本研究针对传统RNA测序技术难以实现小群体神经元空间定位与基因表达关联分析的难题，开发了基于GeoMx数字空间分析(DSP)平台的优化方案。通过CaMKII-α标记人脑额叶FFPE样本中的III/V层锥体神经元，仅需14-21个细胞即可获得高质量RNA-seq数据，为神经退行性疾病机制研究提供了高分辨率空间转录组新工具。

　　

在探索大脑奥秘的征程中，科学家们一直面临着一个关键挑战：如何在保留细胞空间位置信息的同时，精确解析特定神经元亚群的基因表达特征？这个问题对于理解神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)的发病机制尤为重要。传统单细胞RNA测序(scRNA-seq)虽然能提供单细胞分辨率的数据，却完全丢失了细胞在大脑皮层中的精确空间坐标；而激光捕获显微切割(LCM)等技术又需要数百个细胞才能达到测序要求，难以实现小群体神经元的精准分析。

针对这一技术瓶颈，来自美国的研究团队在《Journal of Neuroscience Methods》发表了一项创新研究。他们巧妙地将数字空间分析(Digital Spatial Profiling, DSP)技术应用于人脑福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织，建立了针对III层(L3)和V层(L5)锥体神经元的高分辨率空间转录组分析方法。这项研究不仅突破了FFPE样本RNA质量受限的技术障碍，更将所需细胞数量降至前所未有的14-21个，为神经科学研究开辟了新途径。

研究团队采用了多项关键技术：首先从8例人死后脑组织获取Brodmann 9区(BA9)样本，通过优化Ca²⁺
/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CaMKII-α)免疫染色标记锥体神经元；随后利用GeoMx DSP平台进行空间定位和RNA探针捕获；最后通过NovaSeq 6000测序系统获得转录组数据。样本队列包括年龄39-70岁的对照组和2型糖尿病患者。

CaMKII-α免疫反应性是GeoMx中锥体神经元的可靠形态学标记
研究发现CaMKII-α单克隆抗体能清晰区分BA9的L3和L5，其荧光信号强度足以在GeoMx系统中准确定位单个锥体神经元，为后续空间分析奠定基础。

稀释探针文库无法提供足够的文库浓度测量
初期实验显示，按标准流程稀释的文库浓度(2.93 pg/μL)低于检测限，而未经稀释的样本(21.8 pg/μL)证实问题源于ROI数量不足而非扩增失败，这一发现对后续实验设计具有重要指导意义。

更多ROI可实现严格的RNA-seq分析
优化后收集的94个ROI产生高质量数据：9个分段神经元ROI平均获得8,270,255条原始读长，比对率达91%；54个皮质带ROI则获得11,886,797条读长，显示出该方法对不同规模样本的适应性。

标准化计数在不同ROI类型间存在差异
统计分析显示皮质带ROI的标准化计数(97,769)显著高于分段(43,479)和轮廓神经元(31,083)，但后两者间无统计学差异，证实手动轮廓法可作为分段法的有效补充。

这项研究的意义在于建立了首个针对人脑FFPE组织小群体锥体神经元的高分辨率空间转录组分析方法。通过优化样本处理、免疫标记和探针捕获流程，成功将GeoMx DSP技术应用于神经科学研究领域，克服了传统方法需要大量细胞、丢失空间信息的局限。特别值得注意的是，该方法仅需单个5μm厚切片中的约20个神经元即可获得可靠数据，极大提高了珍贵人脑样本的利用率。

在讨论部分，作者指出FFPE样本的过度固定和抗体批次差异是主要技术挑战，而凝胶包被载玻片和热诱导表位修复的优化有效改善了组织粘附性。虽然当前平台限于约19,000个预定义基因的检测，但全转录组(hWTA)探针组已为发现研究提供充足覆盖。这项技术特别适用于比较不同皮层或疾病状态下锥体神经元的基因表达差异，为理解AD等疾病中特定神经元亚群的退化机制提供了新工具。

展望未来，这种将空间信息与转录组数据相结合的方法，有望揭示大脑皮层精细功能架构的分子基础，加速神经退行性疾病生物标志物和治疗靶点的发现。该团队计划进一步应用此技术研究AD相关痴呆中L3和L5锥体神经元的分子变化，为破解认知衰退的细胞机制提供关键见解。