双质子化荧光染料c-P4VB?2HX的酸碱传感机制及其在生物成像中的应用研究

推荐：本研究针对传统荧光碱传感器检测范围窄、颜色变化小的局限，开发了基于双去质子化反应的distyrylbenzene衍生物c-P4VB?2HX荧光染料。通过光谱分析和DFT计算证实其两阶段去质子化过程可实现584 nm（橙）至490 nm（蓝）的显著荧光位移，量子效率超50%，并成功应用于细胞核pH成像。该传感器在OH– 浓度检测和生物医学监测领域具有重要应用价值。

　　

酸碱平衡监测在工业化学、水处理和生物医学等领域至关重要，但现有荧光传感器如SNARF存在检测范围有限（<10^–5
M OH^–
）、颜色变化幅度小等问题。传统比色法染料如氨基奥辛（aminoorcein）更因缺乏荧光特性难以满足高灵敏度检测需求。针对这些技术瓶颈，研究人员开发了一种基于双去质子化反应的新型荧光染料c-P4VB?2HX（X=Cl等阴离子），其独特的双吡啶基团设计可实现从橙到电蓝色的显著荧光位移。

研究团队通过多步有机合成获得羧基功能化的1,4-双(4-吡啶基-2-乙烯基)苯衍生物。采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和时间分辨荧光技术（TRPL）系统表征了其在乙醇溶液中的光学特性，结合密度泛函理论（DFT）计算阐明了质子化状态对电子结构的影响。通过建立双去质子化平衡模型，量化了OH^–
浓度与荧光颜色的定量关系。最后通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰实现了染料在A549肺癌细胞中的核膜特异性标记。

3. 结果与讨论
3.1 结构表征与光学特性
c-P4VB?2HCl晶体呈现5-100 μm针状结构（Fig. 2），在乙醇中显示456 nm（S₀
→S₁
）和357 nm（S₀
→S₂
）特征吸收峰。双质子化状态（H₂
B²⁺
）发射584 nm橙光（量子效率47%），完全去质子化（B）则蓝移至490 nm（效率74%）。DFT计算显示质子化使发射红移，与实验数据高度吻合（Table 2）。

3.2 双去质子化平衡
建立包含两个平衡常数的反应模型（Eq. 1a-1b），拟合显示第一阶段去质子化常数k₁
=138显著大于第二阶段k₂
=7（Fig. 5a）。温度实验证实升温促进去质子化，90℃时无碱添加样品即呈现完全去质子化状态（Fig. 6），计算得质子结合能为0.26-0.35 eV。

3.3 生物成像应用
NHS功能化染料在水性HEPES缓冲液中保持传感活性（Fig. 7a-b）。细胞实验显示染料特异性标记核区，479/576 nm荧光强度比揭示核内pH可能略高于胞质（Fig. 7f），这与哺乳动物细胞核膜pH梯度假说相符。

该研究创制的双质子化荧光染料突破了现有碱传感器的性能限制：其194 nm的荧光位移幅度远超SNARF染料的48 nm，检测上限提升至400 μM OH^–
。通过巧妙的双吡啶基团设计，实现了对碱浓度的"双保险"响应机制，而温度依赖性则为开发新型环境响应材料提供了思路。在生物医学领域，核区特异性标记特性使其成为研究亚细胞器酸碱平衡的有力工具，特别是为探索核内pH调控机制提供了新方法。未来通过优化水溶性和功能化修饰，该染料家族有望拓展至工业流程监控和微环境成像等更广阔领域。