橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)跨组织发育阶段定量实时PCR内参基因的系统筛选与验证

本研究针对橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)基因表达分析缺乏跨组织发育阶段稳定内参基因的问题，通过RNA-seq筛选12个候选基因，结合7个已知基因，利用geNorm等4种算法评估稳定性，鉴定出组织特异性最优内参组合（如根组织中TkUPL/TkSIZ1），并通过橡胶生物合成基因TkFPS1/TkSRPP2验证可靠性，为橡胶草分子机制研究提供标准化工具。

　　

天然橡胶是战略物资，而橡胶草(Taraxacum kok-saghyz, TKS)因其根部可积累20%以上干重的优质橡胶，成为替代巴西橡胶树的重要作物。然而，解析其橡胶合成机制的关键技术——定量实时PCR(qRT-PCR)面临严峻挑战：既往研究使用的7个内参基因（如ACTB、GAPDH等）缺乏系统性验证，且不同组织（根、叶、乳胶等）和发育阶段的表达稳定性未知，可能导致基因表达数据失真。

为解决这一难题，海南大学的研究团队开展了跨组织发育阶段的内参基因筛选研究。通过对26个样本（覆盖5组织9发育阶段）的RNA-seq数据分析，结合4种生物信息学算法和实验验证，最终在《Journal of Plant Physiology》发表的研究中确立了组织特异性的最优内参组合：全组织组推荐TkADF1/TkRPT6A，根部优选TkUPL/TkSIZ1，乳胶组织适用TkADF1/TkSRPRA。这些发现为橡胶草发育调控和橡胶合成研究提供了精准的分子标尺。

研究采用多组学整合策略：基于TK20种质资源建立跨发育阶段样本队列（24°C，16h光照/8h黑暗），通过RNA-seq筛选候选基因（标准：CV<0.3，FPKM>60）；采用SYBR Green qRT-PCR技术检测19个基因表达量；结合geNorm（M值）、NormFinder（组间变异）、ΔCt法（标准差）和BestKeeper（相关系数）4种算法评估稳定性；最后用橡胶合成关键基因TkFPS1和TkSRPP2进行表达模式验证。

主要研究结果：

1. 候选基因筛选
   从RNA-seq数据中筛选出12个功能多样的候选基因，包括细胞骨架调节因子TkADF1、蛋白转运相关TkVSR、蛋白磷酸化激酶TkCKL2a/b等，其表达丰度（FPKM 60-3,000）和稳定性显著优于传统内参基因。

2. 算法稳定性评估
   geNorm分析显示全组织组中TkADF1/TkRPT6A的M值最低（0.38），而传统内参ACTB稳定性排名垫底（M=1.21）。NormFinder进一步证实TkRPT6A的组间变异最小（0.12），特别适合叶片组织分析。

3. 组织特异性验证
   在橡胶合成关键部位——根部，E3泛素连接酶TkUPL和SUMO连接酶TkSIZ1表现出极强稳定性（ΔCt标准差<0.5）；乳胶组织中TkSRPRA（与橡胶粒子相关）与TkADF1的组合使目标基因TkSRPP2的表达相关性较传统内参提高3倍（R²
   =0.91 vs 0.31）。

4. 生物学意义验证
   当使用优选内参校正时，橡胶合成途径限速酶基因TkFPS1在根中的表达模式与RNA-seq数据高度吻合（Pearson r=0.89），而使用非稳定内参EF1α会导致发育动态趋势误判。

结论与展望：
该研究首次系统建立了橡胶草跨发育阶段的内参基因使用标准，突破性地发现传统看家基因（如ACTB、GAPDH）在特定组织中的不适用性。推荐的TkADF1等新型内参不仅提升橡胶合成相关基因检测精度，其特殊功能（如TkSIZ1参与蛋白翻译后修饰）还暗示内参基因选择需兼顾分子功能背景。研究成果为橡胶草作为模式植物的分子研究奠定方法学基础，尤其对解析橡胶合成时空调控机制具有重要价值。未来可进一步探索这些内参基因在逆境响应研究中的普适性。