开发经济高效的SP3-TMT自动化样本制备流程用于定量蛋白质组学研究

为解决TMT标记肽段制备流程自动化程度低、成本高的问题，研究人员开发了基于Biomek i5液体处理系统的SP3-TMT自动化样本制备方法。该研究通过优化磁珠清洗、酶解和标记步骤，实现了18-plex TMT标记的高通量制备，显著减少人工操作时间至2.8小时/96样本，同时提升定量动态范围。该工作为大规模蛋白质组学研究提供了高效、可重复的技术方案。

　　

蛋白质组学研究近年来因质谱技术的进步而快速发展，但样本制备环节仍存在自动化程度不足、通量受限等瓶颈问题。特别是在使用串联质量标签(TMT)进行多重定量时，传统手工方法耗时长达24小时/96样本，且依赖昂贵的专用设备。更关键的是，现有自动化方案多针对非标记定量设计，而TMT标记流程中固相萃取步骤需要真空装置等特殊配件，限制了技术的普及应用。

针对这一现状，研究人员开发了基于Biomek i5液体处理系统的创新性自动化流程。该方案采用单管固相增强样本制备(SP3)技术，利用磁性微珠实现蛋白质清洗和酶解的一体化操作。通过优化胰酶浓度和肽段-TMT标记比例，不仅将样本处理速度提升至10.8分钟/样本（较ThermoFisher Accelerome快15%），还能显著降低试剂成本——单个16-plex TMT标记成本仅255美元。

关键技术方法包括：1）利用Biomek i5自动化平台完成细胞裂解物标准化、SP3磁珠清洗和Trypsin/Lys-C酶解；2）18-plex TMT-Pro标记及淬灭反应；3）多维蛋白质鉴定技术(MudPIT)结合高分辨质谱(Exploris 480)进行数据依赖采集(DDA)；4）Proteome Discoverer 2.4软件进行数据库搜索和定量分析。研究使用HEK293^DAX
和Fv2e-PERK工程细胞系作为模型，通过小分子诱导激活未折叠蛋白反应(UPR)的不同分支通路。

建立Biomek i5的TMT标记肽段制备流程
研究人员设计的工作流从细胞裂解物标准化开始，通过SP3磁珠实现还原、烷基化、清洗和酶解的自动化操作。与甲醇/氯仿沉淀法相比，磁珠方案可处理70μL起始体积，适应10:1的磁珠-蛋白结合比例。特别设计的LVL管存储系统简化了TMT试剂的自动化分装，配合HEPA过滤系统确保操作洁净度。

手动与自动化制备的性能比较
在鉴定能力方面，两种方法表现相当：手动制备鉴定出24,061个肽段和3,544个蛋白质，自动化方案则为24,052个肽段和3,676个蛋白质，重叠率超过90%。值得注意的是，自动化流程显著提升了ATF6通路标志物（如HSPA5、PDIA4）的检测动态范围，其log₂
fold change较手动方法提高30-50%，而变异系数(CV)保持<10%，证明该方法对高丰度差异蛋白的检测更具优势。

酶解效率与标记效率评估
两种方法在胰酶酶切效率（约85%完全酶切）、半胱氨酸烷基化效率(>99%)和TMT标记效率(>99%)方面表现相当。研究特别验证了1:5的肽段-TMT标记比例（低于厂商推荐的1:25）仍可保证标记效率，使单套5mg TMT试剂可完成50次16-plex标记，大幅降低成本。

UPR通路定量分析验证
在三次独立重复实验中，自动化流程展现出优异的重复性（2,697个蛋白质被稳定检出）。对ATF6通路激活的监测显示，HSPA5等标志物的上调倍数在不同批次间差异<15%，证实了方法的可靠性。与手动制备相比，自动化流程使ATF6标志物的检测灵敏度提升2-3倍，这对研究低丰度调控蛋白具有重要意义。

这项研究的意义在于：1）建立了首个基于Biomek平台的SP3-TMT全自动化工作流，将人工操作时间减少88%；2）通过磁珠技术优化提升了高动态范围蛋白的检测能力；3）验证了低比例TMT标记的可行性，为大规模研究提供经济方案。该技术可扩展至磷酸化蛋白质组、糖蛋白质组等研究领域，其96孔板设计更兼容未来32/35-plex TMT系统。论文发表于《Journal of Proteome Research》，为高通量蛋白质组学研究提供了标准化解决方案。