基于LC-MS/MS的靶向磷酸化蛋白质组学方法揭示斑马鱼PAC2细胞系中mTOR通路动态调控机制

为解决非哺乳动物模型中mTOR通路磷酸化动态研究的技术瓶颈，研究人员开发了基于LC-MS/MS的抗体非依赖性靶向磷酸化蛋白质组学方法，以斑马鱼PAC2细胞系为模型，成功定量了10个内源性磷酸化位点和15个蛋白质，揭示了mTOR通路从指数生长期到平台期的动态调控特征，为跨物种比较生理学和生态毒理学研究提供了新工具。

　　

在生命科学领域，雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）信号通路作为调控细胞生长和增殖的核心枢纽，其研究长期以来集中于哺乳动物模型。然而，对于斑马鱼等非哺乳类模式生物，由于缺乏特异性抗体等工具，mTOR通路的磷酸化动态研究始终面临技术瓶颈。这一空白不仅限制了基础研究的深入，更阻碍了跨物种比较生理学和生态毒理学的发展——要知道，斑马鱼作为环境毒理学的重要指示物种，其应激响应机制与人类疾病模型存在高度保守性。

正是瞄准这一关键问题，研究人员创新性地将液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术应用于斑马鱼永久细胞系PAC2的mTOR通路研究。通过优化样本处理流程和数据分析策略，该团队成功突破了抗体依赖性的技术限制，在《Journal of Proteomics》发表的研究中实现了三大突破：首先，建立了首个适用于斑马鱼细胞的靶向磷酸化蛋白质组学方法；其次，动态监测了细胞不同生长阶段15种mTOR相关蛋白及10个磷酸化位点的变化规律；最后，通过上游调控因子AKT、AMPK与下游效应分子eIF4EBP1、RPS6等关键节点的磷酸化波动，首次系统描绘了斑马鱼mTOR通路从指数生长期向平台期转变的分子图谱。

技术方法上，研究采用PAC2细胞系作为实验模型，通过同步化培养获得不同生长阶段的细胞样本。核心实验流程包括：基于TiO₂
的磷酸化肽段富集技术、高分辨率LC-MS/MS靶向检测（针对mTOR通路相关磷酸化位点设计）、同位素标记定量（SILAC）以及生物信息学通路分析。

研究结果部分，《Abstract》显示：1）在生长动态方面，检测到AMPKα亚基Thr¹⁷²
位点的磷酸化水平随细胞密度增加而显著升高，提示能量应激响应增强；2）信号传导层面，AKT Ser⁴⁷³
和eIF4EBP1 Thr^37/46
的磷酸化呈现负相关波动，证实了哺乳动物中保守的mTORC1调控机制；3）创新性发现RPS6蛋白在平台期出现非典型磷酸化模式，暗示斑马鱼可能存在独特的生长停滞调控策略。《Significance》强调该方法学突破使得在缺乏抗体的物种中开展磷酸化信号研究成为可能，特别适用于环境污染物对mTOR通路影响的机制研究。

结论与讨论指出，该研究不仅验证了斑马鱼与哺乳动物mTOR通路的核心保守性，更通过磷酸化动态差异揭示了物种特异性调控特征。这种抗体非依赖的策略显著降低了研究成本（相比全局蛋白质组学），使得大规模环境毒理学筛查成为可能。未来可延伸应用于：1）水生生物应激响应生物标志物开发；2）跨物种药物靶点保守性评估；3）新型污染物作用机制研究。该技术路径为突破传统抗体限制、推动非模式生物信号转导研究提供了范式转换。