结核分枝杆菌H37Rv PadR家族蛋白Rv0047c的结构与生物物理特性解析及其转录调控机制研究

本研究针对结核分枝杆菌耐药性机制，通过结构生物学和生物物理手段解析PadR家族蛋白Rv0047c的晶体结构（分辨率3.15 ?），揭示其作为二聚体通过保守的wHTH结构域结合自身启动子DNA的特性，证实Y18/Y40残基对DNA结合的关键作用，为理解MDR-TB（多药耐药结核）的转录调控提供新靶点。

　　

结核病（TB）作为全球第二大传染病死因，其病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的耐药性问题日益严峻。世界卫生组织2024年数据显示，全球约40万例多药耐药结核（MDR-TB）患者面临治疗困境。耐药性产生的重要机制之一是细菌通过转录调控过度表达外排泵蛋白，而PadR家族转录调节因子在此过程中扮演关键角色。尽管已有研究表明PadR家族成员如Rv1176c和Rv3488参与结核菌的应激反应和耐药性，但同家族的Rv0047c此前被注释为核相关蛋白NapM，其生物学功能存在争议。

为阐明Rv0047c的真实功能，中国科学院的研究团队在《Journal of Structural Biology》发表了系统性研究。通过X射线晶体学（3.15 ?分辨率）、差示扫描量热法（DSC）、圆二色谱（CD）和电泳迁移率变动分析（EMSA）等技术，揭示了Rv0047c的二聚体结构特征及其DNA结合机制。

关键技术方法
研究采用重组表达纯化Rv0047c蛋白，通过尺寸排阻色谱确认其二聚体状态；利用DSC测定其热稳定性（Tm=55.3°C）；采用X射线晶体学解析三维结构；通过EMSA和CD分析其与38-bp启动子DNA（含5-bp反向重复序列）的结合特性；构建Y18A/Y40A突变体验证关键残基功能。

研究结果

结构与稳定性特征
Rv0047c形成稳定的二聚体，每个单体包含N端翼状螺旋-转角-螺旋（wHTH）DNA结合域（α1-α4螺旋和β1-β2链）和C端二聚化域（α6-α7螺旋），两域通过α5螺旋连接。结构分析发现αa螺旋（残基89-92）使α4-α5环区紧缩，这一特征在PadR-s1亚家族中保守。

DNA结合特异性
EMSA证实Rv0047c特异性结合其自身基因上游-34至-72 bp区域，该序列含5-bp反向重复。CD光谱显示DNA结合诱导构象变化。关键残基Y18和Y40（与BsPadR的Tyr20/Tyr42同源）的突变导致DNA结合能力丧失，说明其通过wHTH域与DNA大沟相互作用。

系统发育与功能关联
多序列比对显示Rv0047c与PadR-s1亚家族成员（如Rv1176c、BsPadR）具有20-21%序列同一性，且保守的DNA结合基序支持其转录调控功能。不同于此前NapM的注释，本研究提出Rv0047c更可能通过调控rv0047c
基因表达参与应激响应。

结论与意义
该研究首次证实Rv0047c是典型的PadR-s1亚家族转录因子，其二聚体结构和DNA结合特性与其他家族成员（如BsPadR、Rv1176c）高度保守。发现Y18/Y40在DNA识别中的关键作用，为设计靶向PadR家族的小分子抑制剂提供了结构基础。鉴于PadR家族在细菌耐药性和毒力中的广泛作用，针对Rv0047c的深入研究可能为开发抗MDR-TB新策略开辟路径。研究成果通过PDB（8JXK）公开，为后续功能研究和药物开发奠定基础。