冷冻电镜解析磷酸转移酶系统葡萄糖转运蛋白IICBGlc 中间态构象揭示新型转运抑制机制

本研究通过冷冻电镜技术首次捕获了细菌磷酸转移酶系统(PTS)关键转运蛋白IICBGlc 的中间态构象，发现其转运域(TD)在n-十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷(DDM)作用下停滞于向内/向外开放的中间态。研究揭示了DDM通过占据葡萄糖结合位点并阻碍"薄门"残基F337位移的分子机制，为靶向细菌糖代谢的抗生素设计提供了新思路。

　　

在细菌与人类持续博弈的战场上，糖代谢系统一直是抗菌药物研发的重要靶点。磷酸转移酶系统(PTS，phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system)作为细菌摄取葡萄糖的核心机制，通过独特的"集团转运"方式将糖类底物跨膜运输并同步磷酸化。其中葡萄糖特异性转运蛋白IICB^Glc
由膜嵌合的IIC^Glc
结构域和可溶性的IIB^Glc
结构域组成，前者负责葡萄糖跨膜转运，后者催化生成可直接进入糖酵解的葡萄糖-6-磷酸。尽管该系统的生理重要性早已明确，但关于其转运过程中的动态构象变化，特别是介于向内开放(IF)和向外开放(OF)状态之间的中间态，始终是未解之谜。

为揭示这一关键科学问题，来自国外研究机构的Patrick Roth和Dimitrios Fotiadis团队运用冷冻电镜(cryo-EM)技术，对大肠杆菌来源的IICB^Glc
进行了高分辨率结构解析。研究人员采用n-十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷(DDM)溶解纯化蛋白，通过冷冻电镜单颗粒分析技术获得2.53 ?分辨率的三维结构，结合分子动力学模拟和结构比对分析，系统阐释了转运过程中的构象变化机制。

【2.1. Cryo-EM结构解析】
研究首先建立了高效的蛋白表达纯化体系，利用BW25113(DE3) ΔarcBΔptsG菌株表达C端带10×His标签的IICB^Glc
。通过镍柱亲和层析和分子筛色谱获得均一蛋白后，采用300 kV Titan Krios冷冻电镜采集9,036张显微图像，经cryoSPARC软件处理获得高质量密度图。值得注意的是，最终结构仅解析出4-386位氨基酸残基，证实IIB^Glc
结构域具有固有柔性。

【2.2. 整体结构特征】
解析的IIC^Glc
呈现典型的二聚体结构，每个单体包含8个跨膜螺旋(TM)和2个发夹结构(HP)。结构域分析显示，支架域(SD)由TM1-5组成，转运域(TD)包含TM6-8，两者通过两亲性螺旋(AH)连接。特别值得注意的是，先前被认为属于柔性连接肽的³⁸²
KTPGR³⁸⁶
序列实际上形成稳定的β-转角结构，参与TD的构象稳定。

【2.3. 中间态构象】
通过与已报道的IF和OF状态结构比对发现，当前结构的TD恰位于两者之间的中间位置。SD与IF/OF状态的RMSD分别为1.12 ?和1.29 ?，而TD的RMSD为0.67 ?和0.68 ?。这种独特的空间排布表明，该结构捕捉到了电梯式转运机制中的关键中间态。

【2.4. DDM结合机制】
高分辨率密度图揭示了两处DDM结合位点：一处位于SD/TD界面的周质侧，另一处则直接占据TD的葡萄糖结合口袋。结构分析显示，DDM的麦芽糖头部通过氢键网络与E298、T297等残基特异性结合，而十二烷基尾部则与F337等残基产生疏水相互作用。这种结合模式与天然底物葡萄糖既相似又存在空间位阻差异。

【2.5. 转运停滞机制】
研究者提出"楔子效应"模型解释转运停滞现象：DDM的麦芽糖头部竞争性占据底物结合位点，同时其庞大的烷基链导致"薄门"残基F337发生水平位移，阻碍TD的完全闭合。这种双重作用使TD在电梯式运动中"卡"在中间位置，形成结构解析所见的中间态构象。

这项发表于《Journal of Structural Biology: X》的研究具有多重重要意义：首先，首次捕获了PTS转运蛋白的中间态构象，填补了电梯式转运机制研究的空白；其次，揭示了DDM通过特异性结合和构象干扰实现转运抑制的分子机制，为开发靶向细菌糖代谢的新型抗生素提供了理论依据；最后，研究提出的"楔子效应"模型可拓展应用于其他膜转运系统的抑制剂设计。特别值得注意的是，基于麦芽糖结构的抑制剂可能通过类似机制干扰PTS功能，这为应对日益严峻的抗生素耐药问题开辟了新思路。