SARS-CoV-2刺突蛋白内标策略的突破：冷冻电镜结构解析与糖基化修饰研究

为解决SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）传统C端标记干扰双向分泌的问题，研究人员通过AlphaFold建模和冷冻电镜（cryo-EM）技术，开发了信号肽下游内嵌双链亲和标签（twin-strep-tag）策略，成功纯化功能性Spike胞外域（ecto-domain）。该研究证实内标不影响ACE2受体（ACE2R）结合或N-糖基化（N-glycan）修饰，为病毒组装和疫苗设计提供了关键工具。

　　

研究背景与问题
冠状病毒的刺突蛋白（Spike）是宿主细胞感染和疫苗设计的核心靶点，其通过内质网-高尔基体双向分泌途径完成翻译后修饰（如N-糖基化）和膜定位。然而，传统C端标记策略会干扰Spike与宿主转运蛋白（如coatomer复合体）的相互作用，导致分泌异常，进而影响病毒组装和疫苗免疫原性。如何在不破坏Spike天然构象和功能的前提下实现高效纯化，成为领域内亟待解决的难题。

研究设计与方法
中国科学院等机构的研究人员结合生物信息学预测与实验验证，提出了一种创新性解决方案：在Spike信号肽下游插入小型双链亲和标签（twin-strep-tag）。通过AlphaFold建模筛选最佳插入位点，利用Expi293F哺乳动物细胞表达系统分泌Spike胞外域（1-1208残基），经Streptactin XT树脂亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）纯化。采用冷冻电镜（cryo-EM）解析2.3-2.8 ?分辨率结构，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析22个N-糖基化位点的修饰特征。

研究结果

1. 信号肽下游位点适合内嵌双链标签
   TOPcons拓扑学分析和AlphaFold预测显示，插入twin-strep-tag后Spike跨膜拓扑不变，且标签构象灵活，不影响受体结合域（RBD）与ACE2R的相互作用。

2. 内标Spike胞外域保持ACE2R结合活性
   SEC和SDS-PAGE证实内标Spike能与ACE2R-Fc融合蛋白形成复合物，结合能力与C端标记构建体相当。

3. 内标对N-糖基化景观影响有限
   质谱分析显示，22个N-糖基化位点中仅Asn165和Asn616的糖型分布与文献报道的C端标记构建体存在差异，其余位点（如S1亚基的Asn343和S2亚基的Asn1098）的糖基化模式高度保守。

4. 冷冻电镜揭示天然构象动态性
   通过3D变异性分析（3D variability analysis）解析出Spike两种构象：三RBD均处于"闭合态"（down-state）和单RBD"开放态"（up-state），分辨率达2.3-2.8 ?。内标未破坏Spike三聚体稳定性或RBD构象转换能力。

结论与意义
该研究首次证明Spike信号肽下游内标策略的可行性，解决了传统C端标记干扰coatomer介导的分泌通路的瓶颈问题。通过保留天然胞质尾序列，该技术为研究Spike-宿主蛋白互作组（interactome）提供了新工具。冷冻电镜结构与糖基化图谱的关联分析，为理解分泌途径中糖型重塑（glycoform remodeling）对疫苗免疫原性的影响奠定基础。论文发表于《Journal of Structural Biology: X》，为下一代冠状病毒疫苗的理性设计提供了关键技术支撑。

技术亮点

1. 多尺度建模：AlphaFold预测结合TOPcons膜拓扑分析指导标签插入位点设计
2. 冷冻电镜技术：采用非对称重构和3D变异性分析解析RBD动态构象
3. 糖组学分析：四酶联用LC-MS/MS实现22个N-糖基化位点的精细表征
4. 功能性验证：SEC结合实验证实内标Spike与ACE2R的天然互作能力