鲨鱼单域抗体助力膜蛋白冷冻电镜结构解析：以透明质酸合酶为例的创新方法与应用

本研究针对膜蛋白结构解析难题，创新性利用鲨鱼单域抗体(VNAR)技术，以透明质酸合酶(CvHAS)为模型，系统优化了抗原制备、免疫策略及抗体筛选流程。通过间接固定法成功获得nM级高亲和力VNAR S2F6，并首次解析膜蛋白-VNAR复合体冷冻电镜(cryo-EM)结构（3.36 ?），为小分子量膜蛋白结构研究提供了新工具。

　　

在结构生物学领域，膜蛋白的研究始终充满挑战。这些镶嵌在细胞膜上的"分子机器"占哺乳动物蛋白质组的30%，却因疏水跨膜区的存在、结构灵活性等特点，使得传统研究手段屡屡受挫。更令人头疼的是，对于分子量小于100 kDa的膜蛋白，冷冻电镜技术也常因样本对比度不足而束手无策。与此同时，作为重要药物靶点的膜蛋白（占现有药物靶点60%），其精细结构的缺失严重制约了新药开发进程。

面对这一困境，中国科学院海洋研究所的研究团队将目光投向了自然界独特的免疫系统——软骨鱼类的单域抗体(VNAR)。这类仅由重链可变区组成的微型抗体（约12 kDa），不仅具有组织穿透性强、可识别凹型表位等优势，其与哺乳动物迥异的进化历程更可能产生针对保守蛋白的新表位抗体。然而，鲨鱼血液中高达300-450 mM的尿素环境（已知蛋白质变性剂）和膜蛋白固有的不稳定性，使得VNAR的制备面临双重技术壁垒。

这项发表在《Journal of Structural Biology: X》的研究，以病毒来源的透明质酸合酶(CvHAS)为模型，建立了一套完整的膜蛋白特异性VNAR开发方案。研究人员首先证实CvHAS在350 mM尿素中能保持结构和活性，破解了鲨鱼生理环境对膜蛋白稳定的疑虑；继而通过间接固定（生物素-链霉亲和素体系）相较传统被动吸附使抗原活性提升2倍；优化单核细胞分离条件使存活率达93%；最终获得亲和力达13.2 nM的VNAR S2F6。冷冻电镜解析显示，S2F6结合在CvHAS胞质糖基转移酶结构域，与已报道的骆驼纳米抗体(VHH)表位截然不同，为后续功能研究提供了新视角。

关键技术包括：1）基于BirA酶的位点特异性生物素标记技术；2）改良密度梯度离心法分离鲨鱼单核细胞；3）TrxA融合表达系统提升VNAR可溶性；4）纳米盘重组技术维持膜蛋白天然构象；5）单颗粒冷冻电镜解析技术。

【抗原制备突破】
研究团队通过SEC纯化获得均一性CvHAS，放射性纸层析实验证实其合成透明质酸(HA)的活性。CD光谱显示350 mM尿素仅引起轻微二级结构变化，活性保留>80%，扫清了鲨鱼尿素环境的应用障碍。独创的间接固定法通过Avi-tag生物素化，使抗原定向固定在链霉亲和素包被板上，较传统被动吸附显著减少结构损伤（活性提升2.1倍）。

【免疫与文库构建】
采用七次渐进式免疫策略（皮下+静脉交替），通过自研兔抗rC5多抗监测到血清IgNAR滴度持续上升。突破性使用密度1.054 g/mL的Ficoll?溶液（含100-200 mM尿素）分离单核细胞，存活率>93%。构建的免疫文库容量达2.3×10⁹
CFU，经三轮淘选后，从49个克隆中鉴定出6类独特VNAR。

【抗体特性解析】
SHuffle? T7表达系统成功解决VNAR二硫键形成难题。ITC测定S2F6的K_D
为13.2±2.6 nM，结构分析揭示其通过CH-π相互作用（TRP93-LEU218）和氢键网络（如HIS195-PHE96）结合CvHAS。值得注意的是，VNAR结合既不干扰酶活性，也不影响热稳定性，暗示其结合位点远离催化中心。

【冷冻电镜应用】
将CvHAS-VNAR复合体重组至含E. coli脂质的纳米盘中，获得3.36 ?分辨率结构。相比单独CvHAS样本的低分辨率密度图，VNAR的"分子标签"作用显著提升了图像对齐精度。结构显示S2F6结合在胞质GT结构域，与已报道的Nb872/Nb881表位无重叠，为多表位抗体联用奠定基础。

这项研究首次实现了膜蛋白-VNAR复合体的结构解析，建立了从免疫策略到结构应用的完整技术链条。其创新点在于：1）定量验证尿素耐受阈值，确立鲨鱼模型适用性；2）开发膜蛋白特异的抗原固定方法；3）提供纳米抗体辅助小膜蛋白结构解析的实证案例。未来通过构象锁定（如化学交联）或竞争筛选策略，有望获得针对特定功能状态的VNAR，为动态膜蛋白研究开辟新途径。正如讨论指出，VNAR与骆驼VHH的表位互补性，为设计"抗体鸡尾酒"式结构探针提供了可能，这种12 kDa的微型抗体或将改写膜蛋白结构研究的游戏规则。