冷冻电镜样品制备中灵活性与空气-水界面效应的解耦研究：以KtrA蛋白为例

本研究针对冷冻电镜(cryoEM)样品制备中空气-水界面(AWI)导致的蛋白亚基解离、变性及取向偏好问题，以钾转运体KtrAB的调节亚基KtrA为模型，通过优化玻璃化时间(6 s→100 ms)和添加配体c-di-AMP(CDA)，显著改善C-lobe结构域密度和取向分布，为高分辨率结构解析提供了双重调控策略。

　　

冷冻电镜(cryoEM)已成为解析生物大分子结构的利器，但样品制备过程中薄液膜环境引发的空气-水界面(AWI)效应和分子柔性仍是获取高分辨率结构的重大障碍。AWI暴露会导致蛋白亚基解离、变性及取向偏好，而分子柔性则引入结构异质性，削弱成像信号。钾转运体KtrAB的调节亚基KtrA虽已获得晶体结构，但其冷冻电镜结构解析却面临C-lobe结构域密度缺失和取向偏好等挑战。来自英国利兹大学等机构的研究团队通过系统性优化制备条件，揭示了AWI与分子柔性对结构解析的协同影响，相关成果发表于《Journal of Structural Biology》。

研究采用单颗粒冷冻电镜技术，结合快速玻璃化(54-2500 ms)和配体稳定策略。通过比较传统滤纸吸干法(6 s)与自吸式芯片(chameleon)超快冷冻(≤100 ms)的效果，利用非均匀重构(cryoSPARC)和二维分类分析结构完整性。添加表面活性剂DDM(0.1×CMC)或C-lobe配体c-di-AMP(CDA)，结合质谱验证样品完整性。

【结果】

1. 常规制备方法的局限性：标准滤纸吸干法制备的样品显示C-lobe密度完全缺失，且存在严重取向偏好（仅5%顶视图）。
2. 超快冷冻的改善效应：将玻璃化时间从6 s缩短至100 ms，C-lobe密度显著增强，但分辨率仍低于核心区域，提示存在固有柔性。
3. 表面活性剂的调节作用：添加DDM可缓解2500 ms长时暴露导致的取向偏好，证实AWI效应具有毫秒级动力学特征。
4. 配体稳定的协同效应：CDA结合使C-lobe构象紧缩，与100 ms超快冷冻联用时，首次获得全部四个C-lobe的密度，且取向分布最优（cFAR值提升）。

【结论】
该研究创新性揭示：① AWI效应在毫秒级时间尺度即可引发蛋白损伤，而传统吸干法的机械作用可能部分抵消长时间暴露的负面影响；② CDA通过双重机制发挥作用——既稳定C-lobe构象又改变其表面电荷分布，从而降低AWI亲和性；③ 针对不同样本需采用"时间控制+化学修饰"的组合策略。这些发现为膜蛋白复合体的冷冻电镜研究提供了普适性方法学指导，特别是对易受AWI影响的柔性区域解析具有重要参考价值。研究同时指出，现有技术仍无法完全消除C-lobe与核心区的分辨率差异，提示未来需开发更精准的柔性建模算法或原位固定技术。