烟曲霉铁载体生物合成关键酶SidF的结构解析与双底物转乙酰酶功能表征

本研究针对烟曲霉铁载体生物合成途径中的关键酶SidF展开深入研究，通过X射线晶体学和SAXS技术首次解析其四聚体结构，揭示其N端结构域维持蛋白可溶性与寡聚化、C端GNAT结构域介导酶活性的分子机制。实验证实SidF可同时利用乙酰-CoA和N5 -羟基-L-鸟氨酸作为底物，提出其可能补偿SidL功能的新观点，为靶向铁载体通路的抗真菌药物开发提供结构基础。

　　

烟曲霉作为一种广泛存在的机会性致病真菌，每年导致数十万例侵袭性肺曲霉病，对免疫缺陷患者尤为致命。随着三唑类抗真菌药物耐药性的全球蔓延，开发新型作用机制的抗菌药物迫在眉睫。铁离子获取系统是烟曲霉致病的关键因素，其中铁载体介导的高亲和力铁摄取途径（SIA）已被证实为重要毒力因子。在铁载体生物合成网络中，转乙酰酶SidF和SidL分别催化不同铁载体前体的生成，但SidF的分子机制及其与SidL的功能关联始终未明。

来自意大利的研究团队在《Journal of Structural Biology: X》发表的研究中，综合运用X射线晶体学（分辨率1.87 ?）、小角X射线散射（SAXS）和酶动力学分析，首次揭示了SidF的四级结构特征与双底物催化机制。通过大肠杆菌表达系统获得重组蛋白，采用分子置换法解析晶体结构，并利用AlphaFold2模型辅助结构解析。酶活检测采用DTNB法监测乙酰转移反应，通过比较野生型与截短体蛋白的功能差异阐明结构-功能关系。

SidF结构表征
晶体结构显示SidF采用独特的四聚体组装方式，单体包含N端（1-191）和C端（227-462）两个结构域。N端结构域维持蛋白可溶性但不含GNAT基序，C端结构域具有典型的β1-H1-H2-β2-β3-β4-H3-β5-H4-β6折叠和V型乙酰-CoA结合裂隙。SAXS证实溶液中四聚体存在，分子量208 kDa，最大尺寸190 ?。

N端结构域功能
截短体实验表明N端单独存在时为单体（21.2 kDa），但在晶体中通过β片层交换形成二聚体。该区域虽无催化活性，但对维持全酶四聚体稳定性至关重要，缺失导致C端结构域溶解度显著降低。

C端截短体特性
去除C端19个残基的SidF C-trim（1-443）形成二聚体（109.1 kDa），酶活性降低70%，证实C端尾部参与四聚体界面形成。该区域邻近乙酰-CoA结合位点，可能通过空间位阻调节底物进入。

底物特异性分析
酶活实验显示SidF对N⁵
-羟基-L-鸟氨酸具有高度选择性（7.03±1.47 μmol/min*mg），而对未羟基化的L-鸟氨酸无活性。值得注意的是，SidF能利用乙酰-CoA（传统认为仅SidL的底物）实现转乙酰作用，暗示其在SidL缺失时可补偿铁载体合成。

结构功能关联
AlphaFold模型显示SidF与SidL结构高度相似（RMSD 3.14 ?，TM-score 0.76），尽管序列同一性仅29%。两者共有的底物识别模式解释了功能冗余可能性，而SidF的过氧化物酶体定位与SidL的胞质分布提示时空差异调控。

该研究首次阐明SidF通过四聚化实现高效催化的分子基础，其双结构域架构为真菌GNAT家族提供了新的结构范式。发现SidF具有补偿SidL的乙酰转移活性，为解释早期基因敲除实验中观察到的铁载体合成代偿现象提供了机制解释。从转化医学视角，SidF四聚体界面和底物结合裂隙的精确解析，为设计特异性抑制铁载体合成的小分子抑制剂奠定了结构基础。鉴于铁载体系统在多种病原真菌中的保守性，该研究成果对开发广谱抗真菌药物具有重要指导价值。