LC-MS/MS技术首次证实马血液中新型稳定雌激素代谢物5α,6α-环氧-雌酮硫酸酯的存在及其生物学意义

本研究通过LC-HRMS/MS技术首次在种马血清中鉴定出新型雌激素代谢物5α,6α-环氧-雌酮硫酸酯（epoxy-E1S），解决了传统放射性标记法无法明确其结构的难题。研究人员利用液液萃取结合高分辨质谱，证实该代谢物具有独特的磺酸基团和环氧结构（m/z 365.5 [M-H]- →285.1/79.9），为雌激素致癌机制中过渡态环氧化物的假说提供了直接证据，对理解类固醇代谢通路及癌症研究具有重要意义。

　　

在类固醇研究领域，雌激素代谢产物的结构解析一直存在挑战。传统观点认为，雌激素环氧化物是致癌过程中极不稳定的中间体，但这一假说缺乏直接证据支持。尤其引人关注的是，早在上世纪80年代就有研究推测，雌激素代谢可能通过形成5α,6α-环氧化物中间体最终生成致癌性儿茶酚雌激素，但这些推测性结构从未被明确鉴定。种马体内异常高浓度的雌酮硫酸酯（E1S）为探索这一科学问题提供了独特窗口——研究人员发现其代谢产物中存在一个既不能被常规紫外检测（280 nm无吸收）、又无法用标准品匹配的神秘峰，暗示可能存在打破芳香环结构的稳定环氧化物。

为破解这一谜题，研究人员采用液相色谱-高分辨串联质谱（LC-HRMS/MS）技术对三匹不同品种种马（23岁花马、11岁纯血马和8岁温血马）的血清样本展开分析。通过优化液液萃取流程，结合QTOF质谱的精确质量测定功能，成功捕获到这个"隐形"代谢物的完整质谱特征。

关键实验方法

1. 样本处理：采集种马颈静脉血，通过液液萃取富集磺酸化代谢物
2. 仪器分析：使用Agilent LC-QTOF和Waters Synapt G2Si两套系统进行负离子模式检测
3. 结构解析：对比E1S标准品（m/z 349.1）的碎片模式，锁定目标物特征离子（m/z 365.5 [M-H]^-
   ）
4. 验证手段：通过中性丢失扫描（丢失SO₃
   ）和理论碎片反应策略确认环氧结构

Animals
研究选用三匹健康种马，其日常饲养条件严格标准化，排除了环境因素对类固醇代谢的干扰。

Results
质谱数据揭示目标代谢物比E1S多16 Da质量数（m/z 365.5 vs 349.1），对应分子式C₁₈
H₂₁
O₆
S。特征碎片离子m/z 285.1（[M-H-SO₃
]^-
）和79.9（HSO₃
^-
）证实磺酸基存在，而质量偏移提示A环环氧化的独特结构。该代谢物在两种品牌质谱仪上重现性良好。

Structural identification
区别于传统GC-MS需要衍生化的方法，LC-HRMS/MS直接检测到5α,6α-环氧-E1S的完整质谱指纹。其稳定性源于环氧基嵌入B环的刚性结构，这一发现改写了类固醇环氧化物必然不稳定的认知。

Conclusions
该研究首次确证5α,6α-环氧-E1S是哺乳动物血液循环中的内源性代谢物，其稳定存在为雌激素致癌机制的"环氧化物假说"提供了关键分子证据。研究者指出，这种特殊结构可能成为新型生物标志物，其分布特性暗示它可能参与远距离细胞信号传递。

讨论部分强调，该发现开辟了三个新研究方向：1）重新评估环氧化物在类固醇代谢中的生物学作用；2）探索环氧-E1S与马科动物生殖特性的关联；3）开发基于HRMS/MS的类固醇代谢组学新策略。论文作者Raeside James等特别指出，种马作为天然的高雌激素模型，为研究类固醇代谢异常提供了不可替代的研究体系。这项发表于《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》的成果，不仅解决了持续40年的科学争议，更建立了复杂基质中痕量稳定环氧化物的检测范式。