冷冻电镜技术优化对称性不匹配大分子复合物结构解析：以鞭毛马达MS/C环为模型的研究

本研究针对冷冻电镜（cryoEM）解析对称性不匹配大分子复合物的技术瓶颈，以鞭毛马达MS/C环（33:34对称性错配）为模型，系统比较了掩膜优化（masked refinement）、局部优化（local refinement）和颗粒扣除（particle subtraction）三种策略。结果表明，颗粒扣除结合对称性扩展可将MS环和C环分辨率分别提升至3.1 ?和3.0 ?，显著改善小亚基解析度，为复杂生物组装体结构研究提供了新范式。

　　

在结构生物学领域，冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryoEM）已成为解析超大分子复合物的利器。然而，当复合物中存在对称性不匹配（symmetry mismatch）时，传统数据处理方法往往束手无策——就像试图用同一把钥匙打开两把不同锁芯的锁。这个问题在鞭毛马达这类复杂机器中尤为突出：其膜上环（MS-ring）和胞质环（C-ring）在E. coli中分别呈现33和34重对称性，这种"33:34"的微妙差异使得结构解析异常困难。

为攻克这一难题，研究人员以沙门氏菌鞭毛马达为模型，在《Journal of Structural Biology》发表重要成果。研究团队首先利用EMPIAR-11597数据库的原始数据，通过cryoSPARC软件进行系统分析。他们创新性地将颗粒扣除技术与对称性扩展相结合，成功将MS环和C环的分辨率分别提升至3.1 ?和3.0 ?，较既往研究提高0.3-1.0 ?。这一突破不仅揭示了FliN^37-62
新结构域，更建立了处理对称性不匹配问题的标准化流程。

关键技术路线包含三个核心环节：首先通过异质性分类（heterogeneous refinement）筛选出20,863个34-mer C环颗粒；继而分别采用掩膜优化、局部优化和颗粒扣除策略处理数据；最终通过对称性扩展（C34）和局部优化获得原子级分辨率。特别值得注意的是，研究采用Segger工具分割密度图，并通过16-bit精度数据处理显著提升计算效率。

【研究结果】
3.1 初始模型揭示对称性异质性
初始均一性优化（homogeneous refinement）显示，C环存在33-36重对称性亚群，其中34-mer占比最高（35%）。这一发现证实鞭毛马达天然存在对称性波动。

3.2 掩膜与局部优化效果有限
单独使用掩膜优化时，MS环分辨率仅达8.9 ?且呈现"圆形平均化"伪影；局部优化虽将MS环提升至5.5 ?，但二级结构仍不可辨。这表明传统方法难以消除C环信号的干扰。

3.3 颗粒扣除实现突破
扣除C环信号后，MS环分辨率跃升至4.1 ?，α螺旋和β折叠清晰可辨。反向扣除MS环后，C环经对称性扩展达到3.0 ?，成功解析FliN^37-62
与FliM_C
:FliN_C
异源二聚体的相互作用细节。

3.4 新发现的结构生物学意义
3.0 ?分辨率图谱显示，FliN^37-42
通过F39芳香残基锚定在FliM_C
:FliN_C
界面，其结合模式与已知的FliH肽段竞争性结合，揭示了SpoA折叠域（SpoA-fold）结合口袋的可塑性。

【结论与展望】
该研究确立颗粒扣除作为解析对称性不匹配复合物的金标准：其一，通过物理扣除干扰信号，克服了软件算法局限；其二，对称性扩展技术可挖掘隐藏的结构信息。这些发现不仅为鞭毛马达组装机制提供新见解，更创立了处理核糖体、病毒衣壳等复杂组装体的新范式。未来，随着16-bit计算和自动化分割算法发展，该策略有望在相分离 condensates（相分离凝聚体）等更复杂体系发挥价值。文末作者特别强调，所有优化后的密度图和坐标已更新至EMDB和PDB数据库，建议学界弃用早期版本数据。