消除酵母连续培养中GLP-1类似肽生产粘度挑战的创新策略

本研究针对GLP-1受体激动剂(GLP-1RAs)工业化生产中因培养液高粘度导致的传质效率下降问题，通过系统分析S. cerevisiae连续培养体系，发现GLP-1前体聚集和Amn1p依赖性细胞聚集双重机制。研究团队采用高pH培养条件和AMN1基因编辑策略，成功开发出具有牛顿流体特性的低粘度培养体系，为生物制药工艺优化提供了新范式。

　　

随着全球糖尿病和肥胖症负担日益加重，胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RAs)已成为革命性治疗药物。然而工业化生产中，微生物宿主表达系统面临培养液高粘度的重大挑战——这不仅降低氧传递系数(K_L
a)，导致代谢副产物积累，还严重影响工艺放大可行性。传统解决方案依赖扩大生产设施，但存在成本高、碳足迹大的缺陷。Novo Nordisk A/S的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究，揭示了酵母连续培养中粘度问题的双重根源，并提出了创新性解决方案。

研究采用三方面关键技术：1) 通过pH梯度实验结合UPLC-MS分析GLP-1前体聚集行为；2) 利用基因编辑构建FLO8/FLO11/AMN1系列突变株；3) 采用微流变仪(microVisc)定量表征不同剪切速率(80-4000 s^-1
)下的流变特性。实验在2L Sartorius BIOSTAT B plus生物反应器中进行，通过连续培养模式监测溶解氧(DO₂
)和氧摄取率(OUR)等关键参数。

【GLP-1肽相关粘度的表征】
研究发现pH 5.3培养时，GLP-1前体通过形成可溶性聚集体导致培养液呈现显著剪切稀化特性。流变学分析显示，粘度主要来自上清液而非细胞沉淀（粘度降低达数量级）。通过建立"碱性提取法/UPLC稀释法"的浓度差值（C_alkalic
-C_dilution
），证实聚集程度与流动行为指数(n)呈负相关(r=-0.92)。

【细胞源性粘度的发现】
在高pH(≥6.2)培养条件下，研究者意外发现第二类粘度来源——表现为轻微剪切增稠特性。通过组分分离实验，确认该粘度源自细胞沉淀而非上清液。钙离子实验揭示这与传统flocculation机制相反：EDTA处理使粘度增加23%，而Ca²⁺
处理使粘度降低40%，同时诱导GLP-1前体聚集。

【AMN1基因的关键作用】
全基因组分析锁定AMN1^D368
等位基因是细胞聚集的主因。构建的AMN1^D368V
突变株(yNN3073)和△AMN1株(yNN2993)完全消除了细胞聚集，使DO₂
稳定在85%以上，粘度降低68%。显微镜观察显示突变株呈现均匀单细胞形态，而野生型形成"蓬松"细胞团。

研究结论指出：1) GLP-1前体聚集通过分子间缠结网络引发剪切稀化，可通过高pH(≥6.2)培养或后处理pH调节解决；2) AMN1依赖性细胞分离缺陷导致剪切增稠，通过基因编辑可转化为牛顿流体；3) 双重解决方案使K_L
a提升3倍，为工业化放大奠定基础。该研究不仅解决了GLP-1生产的瓶颈问题，其揭示的"基因型-流变特性"关联规律，为其他微生物表达系统的工艺优化提供了普适性框架。

值得注意的是，研究者创新性地将产品特性(pH敏感性聚集)与宿主特性(AMN1调控)解耦分析，并证明碱性处理可在澄清后实施，避免细胞裂解带来的杂质问题。这种"上游改造+下游适配"的策略，代表了生物工艺开发的新趋势——将基础生物学认知转化为可放大的工程解决方案。