揭示小鼠胚胎早期分化中Nanog辅助基因的候选者：基于差异熵与网络推断的创新发现

本研究通过差异熵分析和网络推断技术，深入探究了小鼠胚胎植入前阶段内细胞团(ICM)向外胚层(Epi)分化的关键调控机制。研究人员发现转录因子NANOG的表达虽为Epi命运决定所必需，但需与其他因子共表达才能启动分化。通过分析5个时间分辨的单细胞转录组数据集，鉴定出Pecam1、Sox2和Hnf4a三个基因表现出与Nanog相似的表达变异性峰值模式。进一步利用CARDAMOM算法构建基因调控网络(GRN)，揭示这些候选基因在32细胞阶段与Nanog形成互激活回路，共同促进细胞命运转换。该研究为理解早期胚胎发育中细胞命运决定的噪声驱动机制提供了新视角。

　　

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，内细胞团(ICM)分化为外胚层(Epi)和原始内胚层(PrE)的机制一直是发育生物学的核心问题。虽然已知转录因子NANOG是Epi命运决定的关键调控因子，但越来越多的证据表明，仅靠NANOG的表达并不足以启动这一过程。这种"必要但不充分"的现象暗示着存在尚未发现的"辅助基因"，这些基因需要与NANOG共表达才能触发Epi分化。与此同时，单细胞研究揭示了一个有趣的现象：在分化初期，细胞间存在显著的基因表达异质性，这种"噪声"可能是驱动细胞命运决定的原始动力。然而，这些异质性如何转化为明确的细胞命运决定，特别是哪些基因与NANOG协同作用，仍然是未解之谜。

来自比利时布鲁塞尔自由大学等机构的研究团队在《Scientific Reports》发表了一项创新性研究。他们通过整合多种计算生物学方法，系统分析了小鼠胚胎早期发育过程中的基因表达动态。研究人员首先利用差异熵这一量化指标，评估了五个不同时间点的单细胞转录组数据中基因表达的细胞间异质性。随后采用CARDAMOM网络推断算法，构建了参与ICM分化的基因调控网络。这项研究不仅证实了NANOG表达异质性的关键作用，更重要的是鉴定出了三个新的候选辅助基因——Pecam1、Sox2和Hnf4a，并阐明了它们与NANOG的互作机制。

研究采用了多项关键技术方法：单细胞RT-qPCR和RNA-seq技术用于获取不同发育阶段(8细胞至90细胞)的基因表达谱；基于伽马分布的差异熵计算来量化基因表达异质性；CARDAMOM算法进行基因调控网络推断；主成分分析(PCA)和Spearman相关性分析验证数据质量。研究整合了来自Allègre、Guo、Goolam、Posfai和Wang五个独立研究团队的公开数据集，共分析了21个共有基因的表达模式。

结果

Nanog显示出稳健的细胞间熵时间模式

研究发现Nanog的细胞间熵在16细胞至64细胞阶段呈现典型的峰值模式，在32细胞阶段达到最大值。这一模式在所有五个数据集中都保持一致，印证了Nanog作为Epi分化驱动基因的核心地位。相比之下，与PrE命运相关的Gata6基因的熵值从16细胞阶段开始持续下降，这与已知的PrE分化机制相符。

基于熵谱鉴定候选Nanog辅助基因

通过比较21个共有基因的熵变模式，研究人员发现Pecam1、Sox2和Hnf4a三个基因表现出与Nanog相似的峰值型熵变曲线。值得注意的是，虽然Sox2作为已知的Epi因子并不意外，但Hnf4a作为内胚层标志物的入选则出乎意料。这些基因在至少四个数据集中都显示出与Nanog一致的熵变模式，表明这种关联具有较高的可靠性。

Nanog与候选辅助基因间的互激活作用

网络推断分析揭示了一个关键发现：在32细胞阶段，所有三个候选基因都与Nanog形成了相互激活的调控回路。这种互激活网络基序具有两个重要功能特性：一是强化细胞命运转换决策，二是促进基因共表达状态的维持。特别值得注意的是，这些互激活作用发生在Nanog与Gata6形成"开关"调控之前，表明它们可能在分化启动阶段发挥关键作用。

讨论与结论

这项研究通过创新的分析方法，将熵理论与网络科学相结合，为理解早期胚胎发育中的细胞命运决定机制提供了新的见解。研究证实，NANOG的表达异质性确实是Epi分化的关键驱动力，但需要与其他基因的协同作用才能完成这一过程。鉴定出的三个候选辅助基因中，Sox2作为已知的干细胞多能性调控因子，其作用得到了进一步确认；Pecam1作为Epi标志物也符合预期；而Hnf4a的发现则拓展了我们对Epi分化调控网络的认识。

研究提出的"辅助基因"概念具有重要意义：这些基因可能构成一个冗余系统，其中任何一个基因与NANOG的共表达都可能触发Epi分化。这种设计可能提高了发育过程的稳健性，确保在单个基因功能缺失时仍能完成正常发育。此外，互激活网络基序的发现为理解细胞如何从随机噪声中产生有序模式提供了机制性解释——这种相互强化的正反馈既能放大初始的微小差异，又能锁定最终的稳定状态。

从方法论角度看，该研究展示了如何利用公开的单细胞数据资源，通过创新的计算生物学方法获得新的生物学发现。差异熵分析避免了传统Shannon熵在数据离散化过程中的偏差，特别适合处理细胞数量有限的胚胎发育数据。而CARDAMOM算法的应用则实现了从静态表达谱到动态调控网络的跨越，为类似研究提供了范例。

这项研究的发现不仅深化了我们对早期胚胎发育的理解，也为干细胞生物学和再生医学研究提供了新思路。未来研究可以进一步验证这些候选基因的功能，探索它们在不同条件下的表达调控，并将这些发现扩展到人类早期胚胎发育研究中。此外，这种结合熵分析和网络推断的方法框架，也有望应用于其他发育系统和疾病模型的研究中。