山药实时定量PCR内参基因的筛选与验证：UBQ和PP2A的稳定性研究及其在WRKY转录因子分析中的应用

本研究针对山药(Dioscorea opposita Thunb.)基因表达分析中缺乏稳定内参基因的问题，通过转录组数据筛选出9个候选基因（F-box、ACT、GAPDH等），利用geNorm、NormFinder等算法评估其在块茎发育、非生物胁迫等条件下的稳定性。结果表明UBQ和PP2A是最稳定的内参基因组合，而EIF稳定性最差。研究进一步验证了这些基因在WRKY转录因子表达分析中的可靠性，为山药功能基因组学研究提供了关键技术支撑。

　　

研究背景与意义
作为兼具药用和食用价值的作物，山药（Dioscorea opposita Thunb.）在内蒙古中西部地区的推广种植面临盐碱、干旱等逆境挑战。基因表达研究是解析其抗逆机制的关键，而实时定量PCR（RT-qPCR）技术因其高灵敏度成为主流方法。然而，该技术的准确性高度依赖稳定表达的内参基因（reference genes）。现有研究表明，没有普适性内参基因能适应所有实验条件，而山药领域此前缺乏系统性研究。

研究设计与方法
内蒙古农业大学的研究团队以'大河长芋'山药为材料，基于转录组数据筛选出9个候选基因（F-box、ACT、GAPDH、PP2A、18S、GUSB、UBQ、CHC1、EIF），涵盖块茎发育6个时期（90-165天）、根/茎/叶组织及高温（36°C）、低温（4°C）、NaCl、PEG、ABA、MeJA等7种胁迫处理。通过qPCR检测Ct值，结合geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder四种算法评估稳定性，并选用WRKY46a和WRKY51基因验证内参基因的实用性。

关键技术

1. 多条件样本设计：覆盖发育时序、组织差异和7类胁迫
2. 算法交叉验证：整合geNorm（M值）、NormFinder（SV值）、BestKeeper（SD值）和RefFinder综合排名
3. 验证体系：以WRKY转录因子为靶基因对比稳定（UBQ/PP2A）与不稳定（EIF）内参的影响

研究结果

1. 候选基因表达特性分析
Ct值分布显示18S表达量最高（均值6.45-14.19），EIF最低（23.12-34.53）。UBQ和CHC1变异系数最小（3.34/2.79），而EIF波动最大（11.41），初步提示其不稳定性。

2. 算法稳定性评估

• geNorm分析：UBQ在块茎发育（M=0.02）和低温胁迫（M=0.04）中稳定性最佳，EIF在多数处理中M值>1.5（如ABA处理达1.8）
• NormFinder验证：PP2A在组织差异中SV值最低（0.09），而EIF在盐胁迫下SV值高达0.27
• BestKeeper排名：UBQ在高温处理中SD值仅0.32，显著优于EIF（SD=1.12）
• RefFinder综合：UBQ总排名第一（几何均值1.78），EIF垫底（9.00）

3. 内参基因验证实验
以WRKY51基因为例，使用UBQ标准化时表达量变化趋势稳定（2-ΔΔCt波动<1.5倍），而EIF导致假阳性波动（最大差异达4.7倍），证实不稳定内参会显著扭曲结果。

结论与讨论
该研究首次系统鉴定了山药UBQ和PP2A作为"全能型"内参基因的可靠性，其优势体现在：

1. 跨条件稳定性：在发育、组织和胁迫场景下均保持稳定，克服了传统内参（如ACT、GAPDH）的局限性
2. 技术普适性：四种算法结论相互印证，V值分析（V_2/3
   <0.15）表明双内参组合即可满足精度要求
3. 应用价值：为后续WRKY等抗逆基因研究奠定基础，尤其对内蒙古西部逆境育种具有指导意义

值得注意的是，EIF的严重不稳定性与在茄子等作物中的报道一致，提示翻译起始因子可能易受环境调控。该成果发表于《Scientific Reports》，为薯蓣属植物基因研究提供了方法论范本。