基于N-烷基吡啶试剂的化学选择性蛋白质双功能化：1,6-硫醇加成策略在生物医学应用中的突破

本研究针对蛋白质双功能化中存在的化学选择性不足、合成复杂等问题，开发了一种基于N-alkylpyridinium试剂的1,6-硫醇加成新策略。研究人员通过DFT计算指导设计水溶性三功能试剂，实现了半胱氨酸残基的高效、高选择性修饰，并成功将C3毒素改造为兼具靶向性和荧光示踪功能的治疗探针。该工作发表于《Nature Communications》，为精准医疗提供了模块化蛋白质工程新工具。

　　

蛋白质工程领域的突破性进展
在生物医药领域，如何对蛋白质进行精确的双功能化改造一直是重大挑战。传统方法如马来酰亚胺修饰存在化学选择性不足、易水解等问题，而遗传编码非天然氨基酸又面临技术复杂、普适性差的局限。这些问题严重制约了抗体药物偶联物(ADC)和靶向治疗蛋白的开发效率。

针对这一瓶颈，由德国马克斯·普朗克研究所Tanja Weil团队领衔的国际合作研究取得重要突破。研究人员创新性地利用N-alkylpyridinium试剂的独特反应特性，开发出基于1,6-硫醇加成的蛋白质双功能化平台技术。该成果以"Chemoselective dual functionalization of proteins via 1,6-addition of thiols to trifunctional N-alkylpyridinium"为题发表在《Nature Communications》上。

关键技术方法
研究采用DFT计算预测反应位点选择性，设计合成含叠氮、炔烃和四嗪的三功能N-alkylpyridinium衍生物。通过核磁共振(HMBC、COSY)和质谱(ESI-HRMS)验证1,6-加成特异性，建立pH稳定性评价体系。以A549肺癌细胞为模型，结合共聚焦显微镜和Western blot分析C3毒素双功能化后的细胞摄取和Rho蛋白ADP-核糖基化活性。

研究结果

N-alkylpyridinium试剂的理性设计
通过计算Fukui指数发现，N-甲基化和酰胺化使(E)-3-(吡啶-4-基)丙烯酸的C₆
位点f⁺
指数提升至0.17，远高于C₅
位点的0.01。这种电子效应使1,6-加成能垒(ΔG^?
=7.6 kcal/mol)显著低于1,4-加成路径(14.1 kcal/mol)。所开发的试剂水溶性优异(cLog P_o/w
<-2)，两步合成收率达60%。

卓越的化学选择性
在pH 6-9范围内，N-alkylpyridinium与硫醇的反应转化率>95%，且对赖氨酸/N端氨基的选择性比马来酰亚胺提高10倍。即使20倍过量使用，抗HER2抗体的修饰仍保持单一性(MALDI-ToF显示轻链仅增加1490 Da)，而同等条件下马来酰亚胺导致8个非特异性修饰位点。

稳定的生物偶联物
PC8肽修饰产物在生理条件下72小时保持80%完整性，优于马来酰亚胺缀合物(pH 7时3天降解70%)。在1 mM GSH环境中，1,6-加成的可逆性反而成为优势，可实现肿瘤细胞内药物控释。

生物医学应用验证
通过SPAAC(应变促进炔-叠氮环加成)和iEDDA(逆电子需求Diels-Alder)正交反应，将RGD靶向肽和Cy5荧光团同时引入肉毒杆菌C3毒素。改造后的C3-RGD-Cy5能有效内化至A549细胞(300 nM处理5小时使70%细胞变圆)，并通过Western blot证实其对Rho蛋白的持续ADP-核糖基化活性。

研究意义
这项研究建立了蛋白质工程的新范式：① 通过理论计算指导试剂设计，将1,6-加成反应首次应用于生物偶联；② 开发出可规模化制备的三功能试剂库，合成步骤比现有方法减少60%；③ 实现"一锅法"双功能化，操作时间缩短至5小时。该技术已成功用于抗体、纳米抗体和毒素蛋白的精准改造，为开发下一代ADC和多功能治疗蛋白提供了通用平台。特别值得注意的是，C3毒素的重编程突破了其天然只能靶向巨噬细胞的限制，为针对上皮源性肿瘤的Rho信号通路干预开辟了新途径。

未来研究可进一步拓展该平台在双药偶联ADC、诊疗一体化探针等领域的应用。正如作者指出，这种"即插即用"式的蛋白质改造策略，将使非化学专业的生物医学研究者也能便捷地定制多功能生物制剂，加速转化医学研究进程。