基于腺病毒-抗体定点共价偶联的体内靶向基因递送新策略

（编辑推荐）本研究创新性地利用"DogTag-DogCatcher"分子胶系统，将腺病毒载体(Ad)与单链抗体(scFv)共价偶联，实现了B/T细胞的高效靶向感染。通过纤维蛋白HI环插入DogTag肽，构建的Ad5FDgT载体与抗体-DogCatcher融合蛋白自发形成异肽键，在体外使原代B细胞基因转染效率提升60倍，体内特异性提高2-3倍。该平台为细胞工程、基因治疗和疫苗开发提供了模块化解决方案。

　　

【开发基于DogTag/DogCatcher的病毒-抗体偶联系统】
研究团队针对核酸靶向递送的挑战，创新性地将源于肺炎链球菌RrgA蛋白的DogTag肽段插入腺病毒5型(Ad5)纤维蛋白HI环，构建Ad5FDgT载体。通过AlphaFold2预测的纤维蛋白结构显示，该位点能有效展示DogTag而不影响病毒组装。与携带DogCatcher的抗体片段（包括抗mCD40单域抗体F8DgC、抗mCD19单链抗体1D3DgC等）混合后，在生理条件下迅速形成共价异肽键，SDS-PAGE证实纤维蛋白完全移位（65 kDa→105 kDa）。这种"即插即用"式偶联克服了传统基因工程改造腺病毒时遇到的滴度下降难题。

【体外靶向效率的突破性提升】
在磁珠分选的原代细胞实验中，Ad-Ab复合物展现出惊人的细胞特异性：当抗mCD8α scFv-YTS169DgC以0.625倍摩尔比偶联时，T细胞转染效率较未修饰病毒提高58倍（p<0.0001）；而抗hCD19 scFv-FMC63DgC使人类B细胞EGFP表达从基线0.5%跃升至35%。值得注意的是，不同抗体存在特征性的"钟形曲线"效应——抗mCD19抗体在10倍摩尔过量时效果最佳，而抗mCD8α抗体在低浓度时活性最高，提示受体交联密度对内吞途径的差异化调控。

【体内靶向性的验证与局限】
小鼠尾静脉注射5×10¹⁰
vp的Ad5FDgT-1D3复合物后，脾脏B220⁺
B细胞转染率达2.1%，较对照组提高2.3倍（p=0.004），其中边缘区B细胞（IgM⁺
IgD^lo
）响应最显著。但肝脏仍占据总EGFP表达的85%，这与Ad5六邻体蛋白与凝血因子X(FX)的结合特性有关。通过二次氯化铯梯度离心纯化的Ad-Ab复合物保持稳定，Western blot显示纤维蛋白修饰率>95%，为临床转化提供了单组分制剂方案。

【技术优势与转化前景】
相较于传统的纤维替换或基因插入单域抗体(sdAb)策略，该平台具有三大突破：1) 利用临床验证抗体序列构建scFv，避免骆驼科动物免疫的繁琐；2) DogTag在蛋白环状结构的反应效率比SpyTag提升5倍；3) 保持野生型病毒的包装效率（10¹³
vp/批次）。研究者正将该系统与六邻体突变体Ad5HVR48结合，以阻断肝脏 sequestration，为CAR-T细胞体内编程等应用铺平道路。

【现存挑战与改进方向】
尽管在免疫细胞工程中展现出潜力，当前体系仍存在两个关键限制：1) plasmablast细胞因CD19表达下调导致靶向失效；2) 约15%的CD4⁺
T细胞非特异性转染，可能与FcγRIIB受体有关。团队计划在下一代载体中引入：a) 双位点修饰（纤维靶向+六邻体去靶向）；b) 蛋白酶可裂解linker；c) 共刺激分子融合，以提升治疗窗口。这项发表于Molecular Therapy: Methods & Development的研究，为基因药物的精准递送提供了全新范式。