靶向哺乳动物细胞的微型丝状噬菌体质粒基因递送载体研究

本研究创新性地开发了基于M13噬菌体的微型丝状噬菌体质粒（miniphagemid）基因递送系统。通过展示表皮生长因子（EGF）靶向配体和去除原核骨架，显著提高了基因递送效率和安全性。该系统通过优化包装信号（PS）缺失的辅助噬菌体（M13SW8）实现高纯度miniphagemid生产，为靶向基因治疗提供了新策略。

　　

【Abstract】
丝状噬菌体M13因其可展示外源肽段的衣壳和易于修饰的单链DNA(ssDNA)基因组，成为理想的基因递送载体。研究团队构建了基于M13的DNA微型载体（miniphagemid），通过去除原核骨架和噬菌体DNA成分，显著降低了载体免疫原性。通过pIII蛋白展示表皮生长因子（EGF）靶向配体，实现了受体介导的细胞特异性内化。实验证明，miniphagemid在纯化ssDNA和病毒颗粒形式下均能提高报告基因（cmv-luc）表达水平，且通过删除辅助质粒包装信号（PS）进一步优化了包装效率。

【Introduction】
与传统哺乳动物病毒载体相比，M13噬菌体作为非病毒载体具有安全性优势，但缺乏天然哺乳细胞趋向性。研究采用噬菌体展示技术，将EGF融合表达于次要衣壳蛋白pIII，利用表皮生长因子受体（EGFR）介导的内吞作用实现细胞靶向。M13基因组中的f1 ori序列允许其独立于质粒ori进行复制，且病毒颗粒长度与包裹DNA大小成正比，理论上具有极大的转基因容量。原核骨架中未甲基化的CpG基序会抑制哺乳细胞转基因表达，而miniphagemid去除这些序列后显著提高了递送效率。

【Results】
◆ Display of a cell-specific ligand
EGF展示型噬菌体（M13SW7-EGF）的滴度与野生型相当，表明pIII::EGF融合不影响噬菌体活性。MTT实验证实噬菌体颗粒对HeLa细胞无毒性，无论是否复合阳离子聚合物TurboFect。荧光标记显示，EGF⁺
噬菌体在1小时内即被HeLa细胞内化，6小时后定位于核周区域。与完整质粒相比，纯化miniphagemid ssDNA的荧光素酶表达延迟24小时达到峰值，但表达量比完整phagemid高3倍。

◆ Expression efficiency of miniphagemid-mediated gene delivery
在五种细胞系（HeLa、HT-29、MRC-5、A549、HEK293T）测试中，miniphagemid比完整phagemid提高表达量最高达700倍（HeLa）。EGFR⁺
细胞中，EGF展示使基因表达提升40-2,000倍，而EGFR^-
的HEK293T细胞则无此差异。新型辅助噬菌体M13SW8（缺失PS）生产的miniphagemid纯度极高，污染率<3.01×10^-10
，其介导的基因表达比M13SW7进一步提高。

◆ Filamentous phage uptake is independent of EGFR phosphorylation
Western blot分析发现，虽然EGF⁺
噬菌体能通过EGFR内化，但不会引起EGFR酪氨酸1173位点（Tyr¹¹⁷³
）的自磷酸化。这种"信号沉默"的内化特性避免了EGFR下游促增殖信号通路的激活，暗示噬菌体颗粒可能通过空间位阻抑制受体二聚化。

【Discussion】
该研究建立了结合靶向配体展示和载体微型化的新型基因递送平台。约900nm长的丝状噬菌体可通过网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞进入细胞，而更短的miniphagemid（221nt-60knt）更易被内化。与阳离子聚合物TurboFect复合可促进内体逃逸，但不影响靶向特异性。未来需在动物模型中验证该系统的免疫原性和组织靶向性，并探索其他靶向配体的应用。这种模块化设计为遗传病、癌症等疾病的精准基因治疗提供了新工具。

【Materials and methods】
实验采用大肠杆菌JM109生产噬菌体，通过PEG沉淀纯化。构建了含p15a ori和KanR标记的M13SW7辅助噬菌体，并在其pIII引入GGGS linker连接的EGF肽段。通过斑点杂交和ELISA验证展示效率，spot plate法测定包装污染率。细胞实验使用5×10⁷
virions/mL剂量，通过荧光素酶报告系统定量基因表达，BCA法标准化蛋白含量。统计学采用ANOVA和Tukey检验，p<0.05为显著。