可逆荧光探针PFQX1(AF488)实现突触可塑性过程中AMPA受体的动态可视化研究

为解决传统基因编辑技术对AMPA受体(AMPARs)功能干扰的问题，研究人员开发了可逆荧光探针PFQX1(AF488)，通过化学标记实现了对神经元表面天然AMPARs的高时空分辨率成像。该探针揭示了cLTP（化学诱导长时程增强）过程中AMPARs通过胞吐作用向树突棘聚集的机制，为突触可塑性研究提供了非遗传干预的新工具，成果发表于《Science Advances》。

　　

在神经科学领域，突触可塑性是学习与记忆的细胞基础，而α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸型谷氨酸受体（AMPARs）的动态调控是这一过程的核心。然而，传统研究方法依赖基因编辑技术（如荧光蛋白融合或自标记蛋白标签），可能因过度表达或结构修饰干扰受体功能，且无法全面反映内源性AMPARs的生理行为。此外，关于AMPARs在长时程增强（LTP）中通过胞吐还是侧向扩散途径聚集于突触的争议长期存在。这些技术瓶颈和机制争议，亟需一种非侵入性、高时空精度的研究工具来解决。

针对这一挑战，名古屋大学的研究团队开发了一种名为PFQX1(AF488)的荧光探针，通过结合拮抗剂PFQX与pH不敏感的荧光染料AF488，实现了对神经元表面天然AMPARs的快速、可逆标记。该探针的独特设计使其能在不改变受体表达水平的前提下，通过“快照成像”捕捉突触可塑性过程中AMPARs的动态变化。相关成果发表于《Science Advances》，为解析AMPARs的生理功能提供了突破性工具。

关键技术方法
研究团队通过以下方法展开工作：（1）设计并合成基于PFQX配体的荧光探针，筛选出高亲和力的PFQX1(AF488)；（2）利用X射线晶体学解析探针与AMPAR配体结合域（LBD）的相互作用；（3）在HEK293T细胞和原代海马神经元中验证探针的快速可逆结合特性；（4）结合化学标记技术（CAM2(TCO)/Tz(ST647)）区分AMPARs的胞吐与侧向扩散途径；（5）通过化学诱导LTP（cLTP）模型，量化突触AMPARs的聚集机制。

研究结果

1. 探针设计与结构基础
PFQX1(AF488)通过PFQX配体与AMPARs的LBD结合，其AF488荧光团与LBD的带正电区域（如DSG环和Lys⁴⁴⁹
）形成静电相互作用，使亲和力（K_d
=37.2 nM）显著高于母体配体PFQX（K_i
=170 nM）。晶体结构显示，AF488的磺酸基与Arg⁶⁸⁴
结合，揭示了探针高选择性的分子机制。

2. 动态成像优势
在HEK293T细胞中，PFQX1(AF488)可在10秒内完成标记，且信号经洗涤后完全可逆（重复染色一致性达95%）。在原代海马神经元中，探针特异性标记树突棘上的AMPARs，且荧光强度与受体浓度线性相关（K_d
=97.5 nM），不受pH（5-10）或辅助亚基（如TARP γ7）的显著影响。

3. 揭示cLTP机制
通过“前后对比”成像策略，研究发现cLTP刺激后树突棘的PFQX1(AF488)信号增强1.6倍，且该效应被NMDAR抑制剂（AP5/MK-801）或CaMKII抑制剂（KN93）阻断。结合共价标记技术（ST647）证实，新增的AMPARs来自胞吐而非表面扩散——cLTP后仅PFQX1(AF488)信号增强，而ST647标记的受体数量不变。布雷菲德菌素A（抑制胞吐）可完全阻断这一现象，进一步验证了胞吐的主导作用。

结论与意义
该研究通过PFQX1(AF488)突破了传统基因方法的局限性，首次在天然AMPARs水平证实了cLTP中胞吐途径的关键作用。探针的快速可逆特性支持多次动态观测，而化学标记联用策略为膜蛋白追踪提供了新范式。未来，这一技术可拓展至脑片或活体研究，助力精神疾病（如阿尔茨海默病）中突触异常机制的解析。此外，探针设计原则（配体-荧光团协同作用）为其他神经受体标记工具的开发提供了重要参考。

（注：全文细节均依据原文，专业术语如AMPARs、LBD、cLTP等首次出现时已标注英文全称及缩写，上下标格式严格遵循原文，如K_d
、Arg⁶⁸⁴
等。）