NRPS生物合成基因簇的异源表达揭示三取代吡嗪酮类天然产物Ichizinones的合成机制

本研究针对罕见三取代吡嗪酮类天然产物生物合成机制不明的科学问题，通过基因组挖掘和异源表达技术，在Streptomyces sp. LV45-129中鉴定了负责合成新型四肽类吡嗪酮化合物Ichizinone A-C的NRPS（非核糖体肽合成酶）基因簇。研究揭示了由PKS-NRPS杂合系统参与β-氨基酸前体合成的独特途径，为复杂吡嗪酮骨架的定向改造提供了分子基础。

　　

在微生物天然产物宝库中，吡嗪酮类化合物因其独特的2(1H)-吡嗪酮杂环结构和多样生物活性备受关注。这类化合物通常由两个氨基酸通过非核糖体肽合成酶(NRPS)组装成二肽后环化形成，但三取代吡嗪酮（如海洋链霉菌产生的JBIR-56/57）因其四肽骨架和β-氨基酸参与成环的特性，其生物合成机制长期成谜。

德国萨尔大学Andriy Luzhetskyy团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究，通过多学科交叉方法破解了这一难题。研究人员从乌克兰利沃夫大学提供的Streptomyces sp. LV45-129菌株中，分离出结构新颖的ichizinone A-C（9-11），这些化合物在C-6位分别带有乙基、苄基和甲基取代基，其四肽骨架包含L-缬氨酸、D-亮氨酸和特殊β-氨基酸残基。

研究采用基因组扫描结合异源表达策略，将52.6 kb候选基因簇导入模式宿主Streptomyces albus Del14实现异源生产。通过基因敲除实验（靶向PKS基因ichH、硫酯酶ichI和环化酶ichJ）和Marfey法立体构型分析，结合700 MHz高场核磁共振解析结构，揭示了独特的生物合成逻辑。

材料与方法
研究采用antiSMASH预测次级代谢基因簇，构建基于cos15A_gus-AmInt载体的基因组文库。通过Red-ET重组技术构建基因缺失突变体，利用UPLC-QTOF-MS监测代谢产物变化。化合物结构通过¹³
C/¹⁵
N HMBC等二维核磁技术解析，β-氨基酸构型通过Marfey衍生化法确定。

结果解析

1. 结构鉴定：Ichizinone A（9）的¹
   H-NMR显示δ_H
   3.23（H-7）与δ_H
   1.16（H-8/9）相关信号，HMBC中H-11与C-5（δ_C
   122.59）的远程耦合证实了β-乙基吡嗪酮骨架。

2. 基因簇功能：16基因的ichA-ichP簇中，四模块NRPS（ichC/E/F/G）负责线性四肽组装，单模块PKS（ichH）合成3-氧代酸前体，黄素单加氧酶（ichD）可能催化α位氧化。

3. 生物合成模型：①PKS利用乙酰/丙酰/苯乙酰-CoA合成β-酮酸；②NRPS模块依次装载L-Val（ichC）、β-氨基酸（ichG）、D-Leu（ichE）和L-Val（ichF）；③环化酶催化N-端氨基与β-碳缩合形成三取代吡嗪酮环。

讨论与意义
该研究首次阐明四肽型吡嗪酮的合成规则，突破传统二肽环化认知。发现PKS-NRPS跨界协作产生β-氨基酸的创新机制，为设计非天然吡嗪酮衍生物提供酶学工具。尽管ichizinones未显示抗菌活性，其独特的生物合成逻辑为开发基于β-氨基酸的药用骨架开辟新途径。研究还提出ichJ编码的SRPBCC家族环化酶可能代表新的环化酶亚型，这为天然产物环化酶库补充了重要成员。

这项工作通过"基因簇挖掘-异源表达-结构解析-途径重构"的研究范式，为稀有天然产物的发现和生物合成研究提供了经典范例。未来通过调控PKS底物特异性，有望实现更多结构多样的吡嗪酮类化合物的定向生物合成。