CRISPR-Cas9介导的高通量机器人克隆揭示人iPS细胞中同源染色体频繁发生相同基因编辑事件

本研究针对CRISPR-Cas9在人类诱导多能干细胞(iPS)基因组编辑中产生的复杂基因型异质性问题，开发了基于机器人操作的Matrigel三维培养克隆分离技术。通过分析1,000余个单细胞克隆，首次发现iPS细胞中同源染色体倾向于发生完全相同的插入缺失(indels)和同源定向修复(HDR)，该发现为优化基因编辑策略提供了新视角，对建立疾病模型和细胞治疗具有重要意义。

　　

基因组编辑技术CRISPR-Cas9已成为改造人类诱导多能干细胞(iPS)的强大工具，但在实际应用中面临两大挑战：一是编辑产物存在复杂的基因型异质性，包括目标突变、随机插入缺失(indels)和同源定向修复(HDR)产物的混合；二是传统单细胞克隆方法对脆弱的人iPS细胞效率低下。更令人困惑的是，既往研究多基于群体细胞分析，掩盖了单细胞水平的编辑特征。东京都医学科学研究所等机构的研究团队在《Stem Cell Research》发表的研究，通过创新性技术解决了这些难题。

研究团队开发了基于机器人操作的高通量克隆分离系统：将编辑后的iPS单细胞包埋于Matrigel三维基质形成克隆团，利用CELL HANDLER机器人自动识别并挑取100-200μm克隆团，最终实现66.4%的克隆形成率。通过优化图像识别参数，确保单细胞来源克隆的纯度达96.3%。结合扩增子测序和CRISPResso2分析，对RBM20、GRN和ATP7B三个基因位点的编辑产物进行单细胞基因型解析。

研究结果揭示多个重要发现："基因组编辑结果"部分显示，NHEJ/NHEJ纯合编辑(45.3%)显著多于WT/NHEJ杂合编辑(11.2%)，证实编辑呈"全或无"的二元模式；"各种indels诱导特征"部分发现，8bp缺失(CCGGT微同源序列介导)等特定indels在同源染色体上重复出现，1bp插入等低频变异也存在纯合现象；"基因组编辑iPS细胞系的机器人分离"成功获得GRN基因19bp缺失杂合突变等稀有基因型，经数字PCR验证保持50%突变频率，且维持SOX2/OCT4多能性标志物表达。

讨论部分指出，该研究首次系统揭示iPS细胞中同源染色体倾向于发生相同编辑的规律，可能源于：细胞周期依赖性修复机制使一条染色体编辑产物成为另一条的修复模板；MMEJ介导的缺失具有序列偏好性。研究者建议通过调控Cas9活性或使用RAD51刺激剂RS-1来优化杂合突变获得效率。所建立的机器人克隆平台可兼容RNP电转等新型编辑方式，为构建疾病模型库提供标准化方案。

这项研究的技术创新在于将三维培养与机器人操作结合，使单细胞克隆通量提升10倍；科学发现则重新定义了iPS细胞的编辑规律，为基因治疗产品开发提供质量控制新标准。特别是GRN基因杂合突变系的成功建立，为额颞叶变性等神经退行性疾病研究提供了理想模型。未来通过整合CEPT鸡尾酒等抗凋亡方案，有望将克隆效率进一步提升至临床应用要求水平。