流感病毒神经氨酸酶活性位点邻近检测技术(NASPA)的建立及其在疫苗株筛选与抗体应答分析中的应用

为解决流感疫苗中神经氨酸酶(NA)抗原株筛选缺乏高效检测方法的难题，美国FDA团队开发了NA活性位点邻近检测技术(NASPA)。该技术通过大体积抑制剂替代传统ELLA中的唾液酸化糖蛋白底物，可快速区分空间位阻与活性位点结合的NA抑制性(NAI)抗体，且不受血凝素(HA)抗体干扰。研究证实NASPA能准确反映B型流感Victoria谱系疫苗株NA的抗原漂移，为含NA成分疫苗开发提供了重要技术支撑。

　　

流感疫苗研发长期面临"重HA轻NA"的困境。虽然神经氨酸酶(NA)作为流感病毒表面关键糖蛋白，在病毒释放和传播中起重要作用，但疫苗株选择始终以血凝素(HA)抗原数据为主导。这种现状源于NA抗原性检测的技术瓶颈——传统酶联凝集素试验(ELLA)使用唾液酸化糖蛋白底物，不仅操作繁琐耗时，更易受抗HA抗体干扰产生假阳性。随着含NA成分疫苗成为新一代流感疫苗研发热点，建立快速、特异的NA检测方法成为当务之急。

美国食品药品监督管理局(FDA)的Robert Daniels团队在《npj Vaccines》发表研究，开发出神经氨酸酶活性位点邻近检测技术(NASPA)。该技术通过三步反应设计：先使血清样本与病毒NA作用，再加入大体积NA活性位点抑制剂(NAi)，最后用荧光底物MUNANA检测剩余活性。当血清含空间位阻型NA抑制性(NAI)抗体时，会阻碍NAi结合导致活性升高；若含活性位点结合型抗体，则协同抑制使活性降低。研究采用H1N1/H3N2疫苗株及B型流感病毒验证，结合单克隆抗体分析、抗原漂移追踪和人类血清检测等多维度实验。

关键技术包括：1)构建含不同NA的H6重组病毒株；2)开发广谱NA抑制性单克隆抗体(NAi-MAb)如FNI-9；3)化学合成生物素化唾液酸苷抑制剂(4-guanidino-Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc-βProNH-PEG4-Biotin)与链霉亲和素复合物；4)采用Triton X-100处理消除HA干扰；5)分析28例H1N1感染者血清的NAI抗体谱。

NASPA开发与原理验证
研究团队用H1N1/CA09病毒验证技术原理时发现，传统ELLA检测中抗HA抗体会使NA活性假性降低50%以上，而NASPA通过改用小分子底物MUNANA和添加去垢剂，完全规避了这种干扰。通过比较三种NAi-MAb(FNI-9/FNI-19/1G01)的表现，证实FNI-9具有最广谱的结合能力，对H1N1、B型流感NA的半数抑制浓度(IC₅₀
)均在μg/ml级。

疫苗株兼容性优化
针对季节性疫苗包含的H1N1(A/Brisbane/02/2018)、H3N2(A/Hong Kong/4801/2014)和B型(B/Austria/1359417/2021)毒株，NASPA均展现良好检测性能。特别发现H3N2病毒存在血清成分非特异性结合问题，通过优化Triton X-100浓度(0.025-0.1%)得以解决。重组NA与病毒NA检测结果的高度一致(r=0.92)，进一步验证了方法的可靠性。

抗体抑制机制解析
在分析27株NA单克隆抗体时，NASPA不仅重现了ELLA的效价数据(R=0.9)，更首次发现6G1-1等抗体通过活性位点结合发挥作用。对H3N2毒株NA的特殊变异(E344K)，研究者通过NAi-MAb轻链R27D改造，使抑制活性提升10倍，揭示该方法可灵敏捕捉NA抗原性变异。

抗原漂移追踪应用
分析2007-2019年H1N1疫苗株显示，CA09毒株NA与后续毒株(MI15/BR18/Vic19)存在明显抗原差异。对B型Victoria谱系毒株(2008-2021)的检测发现，NA抗原性呈渐进式演变，但Austria21(2021)毒株抗血清对早期毒株仍保持交叉反应，提示NA进化可能通过优势表位转换实现。

人类抗体应答特征
在28例H1N1/CA09感染者血清中，NASPA联合MUNANA检测揭示：61%含活性位点结合型NAI抗体，21%含空间位阻型抗体，18%兼具两种机制。蛋白A/G吸附实验证实这些抑制确实由抗体介导。这种复杂的抗体谱系提示，多次流感暴露可能促进活性位点抗体的产生。

这项研究建立的NASPA技术具有三大突破性价值：首先，其模块化设计支持NAi-MAb或合成抑制剂等多种检测方案，30分钟即可完成血清孵育，较传统ELLA缩短5小时；其次，首次实现空间位阻与活性位点抑制抗体的区分，为疫苗免疫机制研究提供新维度；最重要的是，该方法可直接使用HA抗原性分析的现有毒株和血清资源，使大规模NA抗原监测成为可能。研究者特别指出，成人血清中广泛存在的活性位点抗体，可能解释含NA疫苗在临床试验中表现出的交叉保护现象。该技术已申请国际专利(PCT/US2024/054840)，将为流感疫苗从"HA单靶标"向"HA-NA双靶标"的战略转型提供关键技术支撑。