基于细胞免疫荧光高通量筛选技术发现甲型流感病毒H3N2/H1N1亚型抑制剂及其结构优化潜力研究

为解决流感爆发期间快速鉴定新型抑制剂的迫切需求，研究人员采用高灵敏度细胞成像技术（HTS）对20万种化合物库进行筛选，发现3个主要结构簇（含选择性指数54.3-252的候选化合物），为靶向宿主因子和病毒生命周期多环节的抗流感药物开发提供新起点。

　　

流感病毒的频繁爆发和潜在大流行风险对全球公共卫生构成持续威胁，尤其当病毒发生抗原漂移或获得耐药性时，现有药物如神经氨酸酶抑制剂（NAIs）的疗效可能受限。传统抗流感药物研发多聚焦于病毒蛋白靶点，但宿主细胞因子作为辅助病毒复制的关键环节，近年来成为广谱抗病毒策略的新突破口。然而，如何通过高通量手段快速锁定既能阻断病毒生命周期多阶段、又避免损伤宿主细胞的化合物，仍是领域内亟待解决的技术难题。

美国阿拉巴马大学伯明翰分校的研究团队在《Antiviral Research》发表的研究中，建立了一套创新的双功能检测体系。该研究利用A549人肺上皮细胞系，通过低感染复数（MOI=0.1）接种H3N2亚型流感病毒株A/Udorn/72，开发出可同步检测病毒抑制率和细胞存活率的免疫荧光成像方法。研究人员筛选了包含98,034个Murcko骨架的20万种化合物库，最终鉴定出161个具有显著抗病毒活性且低毒性的先导化合物，其中核心结构簇A的衍生物对2009年大流行株A/California/07/09（H1N1）展现出最高252的选择性指数（SI）。

关键技术包括：1）基于抗流感抗体-荧光标记的直接病毒检测技术；2）双功能（duplex）高通量筛选平台，同步评估化合物抗病毒活性和细胞毒性；3）跨亚型验证体系（H3N2和H1N1毒株）；4）采用ChemDiv商业化合物库进行类药性筛选。

【Cell culture】
A549细胞在OptiMEM I低血清培养基中的适应性培养为实验提供均一性良好的宿主细胞模型。

【Compound library, control and reference compounds】
筛选使用10μM浓度标准化处理，阳性对照Pimodivir（VX-787）在0.1μM实现完全抑制，其IC₅₀
范围为0.39-200 nM。

【Results and Discussion】
研究发现，主要结构簇A中的SRI-44211、SRI-44215和SRI-44221对H1N1亚型呈现显著选择性，其中SRI-44221对A/California/07/09的SI值达252，远高于同类化合物。通过分析23个次要结构簇和86个单体的构效关系，证实Murcko骨架的特定修饰可显著提升抗病毒特异性。

【CRediT authorship contribution statement】
通讯作者Richard Whitley负责项目资助，Lynn Rasmussen完成方法学设计，Corinne Augelli-Szafran参与实验监督，第一作者Paige Vinson主导论文撰写与数据可视化。

结论表明，该双功能筛选策略突破传统CPE（细胞病变效应）检测法的局限性，首次实现单次实验同步获取病毒抑制率和细胞活力数据。结构簇A的核心骨架展现出跨亚型抑制潜力，其通过干扰宿主因子而非直接靶向病毒蛋白的作用机制，为应对流感病毒耐药性提供新思路。研究获得美国国立卫生研究院（NIH）U19 AI142759项目支持，相关化合物已进入先导化合物优化阶段。