磷酯酶在合成对映体纯ProTide前药中的关键作用及立体选择性调控机制

为解决抗病毒药物ProTide前药立体异构体合成效率低、组织靶向性差异大的问题，研究人员系统研究了磷酯酶(PTE)在立体选择性水解磷酰胺酯前体中的应用。通过定向进化获得G60A-PTE和In1W-PTE等变体，实现了SP 和RP 异构体的高效分离，为Remdesivir和Sofosbuvir等药物的精准合成提供新策略。该成果发表于《Chemico-Biological Interactions》，为抗病毒药物的组织特异性递送奠定基础。

　　

病毒性疾病如COVID-19、HIV和肝炎的持续威胁，使得抗病毒药物开发成为全球焦点。ProTide前药（磷酸酰胺酯核苷酸类似物）因其卓越的细胞渗透性和靶向性成为明星药物，如Remdesivir和Sofosbuvir。然而，这些药物的生物活性高度依赖磷中心的立体构型（R_P
或S_P
），而传统化学合成难以高效获取单一异构体，且不同异构体在组织中的激活效率差异显著。例如，Sofosbuvir的S_P
-异构体抗HCV活性比R_P
-异构体高18倍，而Remdesivir的两种异构体在不同组织中表现迥异。这一瓶颈严重限制了药物的全面开发和临床应用。

针对这一挑战，研究人员聚焦于源自Brevundimonas diminuta的磷酯酶（Phosphotriesterase, PTE）。这种酶以水解有机磷化合物著称，其独特的(α/β)₈
桶状结构和双核金属活性中心，使其能够立体选择性地切割磷酯键。通过定向进化技术，团队筛选出G60A-PTE（增强S_P
选择性）和插入突变体In1W-PTE（特异性水解S_P
-异构体），并发现W131M突变可显著提升对R_P
-异构体的识别能力。

关键技术方法
研究采用酶动力学分析测定变体对磷酰胺酯前体的催化效率（k_cat
/K_m
），结合³¹
P NMR监测立体异构体纯度；利用计算机辅助设计（Triangle Matcher程序）预测突变体与底物的相互作用；通过化学-酶法联用策略合成光学纯ProTide前体。

研究结果

4.3.1. PTE在Remdesivir合成中的应用
In1W-PTE对含2-乙基丁醇酯的Remdesivir前体（化合物2）表现出5.4×10⁵
M^-1
s^-1
的催化效率，且对S_P
-异构体的选择性超过200倍，最终获得R_P
-Remdesivir（异构体纯度>99%）。

4.3.2. PTE的定向进化
W131M突变通过扩大小基团口袋，使PTE对R_P
-异构体的活性提升3000倍。组合突变I106A/W131M-PTE更实现300倍R_P
选择性，填补了S_P
-Remdesivir合成的技术空白。

4.4. PTE技术的优势
与传统色谱分离或结晶法相比，酶法可在前体阶段消除非目标异构体，避免后续纯化步骤。例如，G60A-PTE处理Sofosbuvir前体（化合物1）后，S_P
-异构体残留量低于NMR检测限。

结论与展望
该研究建立了PTE介导的ProTide立体选择性合成新范式，其意义在于：① 解决异构体依赖的组织靶向难题，如In1W-PTE制备的R_P
-Remdesivir更适用于多器官感染的COVID-19；② 为长效ProTide（如含二十二醇的Tenofovir前药）开发提供技术储备；③ 拓展至生物传感领域，如癌症特异性荧光探针的立体构型调控。未来，Sphingobium PTE（Sb-PTE）可能进一步解决磷酰胺酯前体的苯基水解难题，推动更广谱的药物设计。

这项由国外团队完成的研究，不仅为抗病毒药物研发注入新动能，更展示了酶工程在解决药物化学关键问题中的强大潜力。