乳腺癌研究中新型管家基因的筛选及其在临床与实验应用中的稳定性验证

本研究针对传统管家基因（HKGs）在乳腺癌研究中表达不稳定的问题，通过TCGA和GEO数据库筛选、qPCR/ddPCR验证及单细胞RNA测序分析，鉴定出EIF4H、GHITM等16个新型HKGs。这些基因在乳腺癌细胞系、治疗条件及PAM50分型系统中均表现出优于GAPDH的稳定性，为基因表达标准化和精准诊疗提供了可靠工具。

　　

在基因表达研究中，管家基因（Housekeeping Genes, HKGs）被视为“分子标尺”，用于校正实验误差。然而，传统HKGs如GAPDH和ACTB在乳腺癌等病理状态下表达波动显著，导致数据失真。例如，临床常用的PAM50分型系统依赖HKGs标准化基因表达，但现有参考基因的局限性可能影响分型准确性。这一问题在个性化治疗时代尤为突出——不可靠的标准化会误导治疗方案选择。

为解决这一挑战，来自成均馆大学的研究团队通过多组学整合分析，筛选出16个新型HKGs，并验证其在乳腺癌细胞系、药物处理及放疗模型中的稳定性。相关成果发表于《Computers in Biology and Medicine》，为乳腺癌研究提供了更精准的分子标尺。

关键技术方法
研究团队采用四步策略：1）基于TCGA数据库的1217例乳腺癌及癌旁组织RNA-seq数据，筛选高表达（RPKM>20）、低变异（CV<3%）且与癌症通路无关的候选基因；2）通过跨外显子引物设计优化qPCR检测；3）在MDA-MB-231等四种乳腺癌细胞系中，用激素（如雌二醇E₂
）、化疗药（如阿霉素）及γ射线处理模拟临床场景；4）结合GEO数据集和单细胞RNA-seq（13,971个癌细胞）进行跨平台验证。

研究结果

3.1 通过生物信息学筛选候选HKGs
从TCGA数据中初筛20个基因，排除4个无法设计跨外显子引物的基因后，锁定16个候选基因。值得注意的是，传统HKG GAPDH因癌/正常组织差异表达（p<0.05）被排除，而核糖体蛋白基因RPLP0成为唯一入选的已知HKG。

3.2 细胞系基础表达验证
在未处理的MCF7等细胞中，候选基因平均CV值（4.03）仅为GAPDH（14.41）的1/3。其中EIF4H和ATP5F1B表现最优，而溶酶体相关基因LAMP1稳定性相对较低（CV=7.95）。

3.3 治疗条件下的稳定性测试
经8种药物（如2.5μM多西他赛）和6Gy辐照处理后，EIF4H保持最低整体CV（5.08）。ddPCR进一步证实ATP5F1B在曲妥珠单抗处理组中浓度变异度比GAPDH低60%。

3.4 多队列交叉验证
在GSE162187等5个独立数据集中，EIF4H、GHITM和ATP5F1B的综合评分（25-50分）显著优于GAPDH（114分）。单细胞数据揭示GAPDH在30%上皮细胞中零表达，而候选基因覆盖率达95%以上。

3.5 PAM50分型系统应用
使用EIF4H标准化后，PCA分型的轮廓系数（0.193）接近原始数据（0.216），而GAPDH导致正常样亚型出现负值（-0.070）。层次聚类显示，Top5候选基因组合使亚型对齐分数提升至0.769，远超GAPDH的0.124。

结论与意义
该研究建立了乳腺癌特异性HKGs筛选体系，证实EIF4H等基因在转录组标准化中的优越性。其创新性体现在：1）首次系统评估HKGs在放疗、靶向治疗等临床相关场景的稳定性；2）通过单细胞分辨率揭示传统HKG的细胞异质性缺陷；3）为PAM50等诊断工具提供优化方案。未来需在蛋白水平验证这些基因的稳定性，但其在RNA层面的可靠性已为乳腺癌基础研究与临床检测提供了新标准。