基于抗体探针的植物病毒复制酶活细胞成像技术揭示PlAMV复制复合体动态定位

本研究针对植物正链RNA病毒复制酶难以在活细胞中可视化追踪的难题，开发了基于HA标签抗体探针（FB-mCherry）与诱导表达系统的双组分标记技术。东京农业大学团队通过构建HA标记的功能性PlAMV病毒复制酶，结合内质网标记ER-GFP和dsRNA示踪系统，首次实现了活体植物细胞中病毒复制酶的精确定位，发现其在内质网和胞间连丝（PD）附近形成颗粒状复制复合体（VRC），为研究病毒复制机制提供了新工具。该成果发表于《Plant Physiology》。

　　

植物正链RNA病毒（(+)RNA病毒）的复制过程一直是植物病理学研究的热点，这些病毒通过劫持宿主细胞膜系统形成病毒复制复合体（VRC）来完成基因组扩增。然而，由于病毒复制酶分子量大（通常超过150kDa）、功能复杂，传统荧光蛋白标记往往会干扰其活性，导致活体追踪困难。目前对Potexvirus属病毒（如PlAMV和PVX）复制酶的空间动态认知，主要来自固定样本的免疫染色或非功能性截短蛋白的异位表达，无法真实反映感染过程中的酶活状态。

东京农业大学的研究团队创新性地将动物细胞开发的HA标签抗体探针（Frankenbody，FB）引入植物系统。该团队以模式病毒Plantago asiatica mosaic virus（PlAMV）为研究对象，通过基因工程在病毒复制酶C端插入单个HA标签，同时保留其复制活性。为解决探针本底信号干扰，他们设计了病毒复制依赖的双组分诱导系统：当病毒复制时表达XV转录因子，进而激活FB-mCherry的特异性表达。结合内质网标记ER-GFP和dsRNA结合蛋白B2:GFP的共定位分析，实现了多维度活细胞成像。

关键技术包括：1）构建HA标签的PlAMV复制子（PlAMV replicon-HA）和全长病毒（Li1-replicase-HA-XV）；2）开发XV转录因子调控的FB-mCherry诱导表达系统；3）利用转基因本氏烟（B2:GFP株系）进行dsRNA原位示踪；4）共聚焦显微镜动态观察亚细胞定位。

【结果】
"HA frankenbody(FB) is targeted to HA-tagged endoplasmic reticulum(ER)-GFP in planta"
通过ER-GFP融合蛋白的对照实验证实，FB-mCherry能特异性识别HA标签且不影响靶蛋白定位。含3个HA标签的ER-GFP-3HA使探针信号增强3.5倍，但为保持复制酶活性，后续实验采用单HA标签策略。

"Subcellular localization of FB-mCherry expressed under the control of the 35S promoter does not change upon co-expression with an HA-tagged PlAMV replicase"
组成型表达FB-mCherry时，因探针过量导致核质弥散信号。Northern blot验证HA标签不影响病毒负链RNA合成，但传统表达系统无法有效示踪复制酶。

"Development of a two-component system that enables replication-dependent expression of FB-mCherry"
创新的XV诱导系统实现病毒复制与探针表达的耦合。免疫印迹显示仅当病毒（Li1-XV或Li1-replicase-HA-XV）存在时才能检测到FB-mCherry，且膜组分中复制酶含量相当。

"Replication-dependent expression of FB-mCherry results in fluorescent granule formation in cells infected by PlAMV encoding an HA-tagged replicase"
活细胞成像揭示HA标记复制酶形成1.0-5.0μm颗粒，沿细胞膜分布并与内质网相邻。Northern blot证实FB结合不影响病毒RNA积累。

"FB-mCherry granules formed during Li1-replicase-HA-XV infection are located in close proximity to PD and dsRNA granules"
苯胺蓝染色显示复制酶颗粒与胞间连丝（PD）共定位，B2:GFP标记证实其与病毒dsRNA复制中间体空间关联，首次直接证明功能性复制酶在PD处富集。

【结论与意义】
该研究建立了首个植物病毒复制酶的活细胞标记体系，突破性地实现了以下发现：1）功能性PlAMV复制酶通过内质网-胞间连丝途径动态分布；2）病毒复制位点（VRC）与细胞间通道存在物理偶联，暗示复制与运动协同机制；3）抗体探针技术可兼容其他表位标签（如ALFA、SNAP等），为植物微生物互作研究提供通用工具。Ken Komatsu团队开发的这项技术，不仅为解析Potexvirus属病毒的复制机制提供直接证据，其诱导表达策略更可拓展至宿主因子共定位研究，对开发新型抗病毒策略具有重要指导价值。